重楼皂苷类化合物溶血作用研究
作者：沈放，杨黎江，彭永芳，路斌，马银海
【摘要】 目的通过研究重楼皂苷类化合物的溶血作用，为重楼的进一步开发和利用提供依据。方法以分离纯化获得重楼总皂苷、偏诺皂苷PHAC-A和薯蓣皂苷PHAC-B为实验材料，经梯度稀释后用常规肉眼观察法和分光光度法测定样品对兔血红细胞的溶血度。结果当重楼总皂苷和(PHAC-A)在浓度大于等于50 μg·ml-1时、 (PHAC-B)浓度大于等于75 μg·ml-1时溶血率>5%，3种样品的溶血作用均表现出剂量依存关系。结论重楼皂苷中主要产生溶血作用的化合物为PHAC-A。重楼皂苷类化合物在特定浓度下不具有溶血作用，将其运用于静脉注射具有一定的可能性。
【关键词】 重楼； 重楼总皂苷； 偏诺皂苷； 薯蓣皂苷； 溶血
中药重楼为云南重楼Paris polyphylla Smith varyunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz和七叶一枝花P. polyphylla Smith var. chinensis(Franch.) Hara的干燥根茎，在《本草纲目》中以蚤休之名收载，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效。现代药理学研究表明，重楼具有止血、抗肿瘤、免疫调节、抑菌、镇痛等广泛的药理活性［1］，主要活性成分为甾体皂苷类化合物［1，2］。由于甾体皂苷是一类表面活性剂，有很强的乳化力，具有溶血通性，可使红细胞破裂给机体带来严重危害，极大地限制了重楼的临床应用进一步开发。近年有文献报道称重楼总皂苷可在一定剂量内运用于静脉注射［3］，因此，本文研究了重楼总皂苷和其中的两种主要皂苷类成分偏诺皂苷（PHAC-A）和薯蓣皂苷（PHAC-B）的溶血作用及其与剂量的相关性。
1 材料与仪器
1.1 仪器与试剂高效液相色谱仪（美国Agilent 1100），恒温水浴箱（土耳其NüVE），低温离心机（Eppendorf 5804R），酶标仪（美国SPECTRAmax 190），微量分析天平（瑞士梅特勒XS205DU）。试剂为国产分析纯。
1.2 动物日本大耳兔，体质量2.5～3.0 kg，雌雄不限，由昆明医学院动物科提供。
2 方法
2.1 样品精密称取重楼总皂苷（由昆明学院天然产物研究所分离获得），置烧杯中，加约20～25倍（质量体积比）甲醇，超声波处理40 min，取出，放冷至室温后用甲醇稀释至含重楼提取物3%的浓度（质量体积比），摇匀滤过，收集滤液，使其通过SEP-PAK C18柱，以70%甲醇洗脱，收集洗脱液于水浴蒸干，作为供试品偏诺皂苷（PHAC-A），薯蓣皂苷（PHAC-B）。
重楼总皂苷、PHAC-A，PHAC-B由昆明学院天然产物研究所鉴定，各样品主要成分含量﹥98%。其中PHAC-A包含偏诺皂苷元-3-O-α-L-鼠李吡喃糖-(1→4) -α-L-鼠李吡喃糖-(1→4) -［α-L-鼠李吡喃糖-(1→2)］ -β-D-葡萄吡喃糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-鼠李吡喃糖-(1→2) -［α-L-鼠李吡喃糖-(1→4)］ -β-D-葡萄吡喃糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯呋喃糖-(1→4) -［α-L-鼠李吡喃糖-(1→2)］ -β-D-葡萄吡喃糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-鼠李吡喃糖-(1→2) -β-D-葡萄吡喃糖苷，共4种偏诺皂苷。PHAC-B包含薯蓣皂苷元-α-L-鼠李吡喃糖-(1→2)- β-D-葡萄吡喃糖苷、薯蓣皂苷元-α-L-鼠李吡喃糖-(1→4)-β-D-葡萄吡喃糖苷、薯蓣皂苷元-β-D-葡萄吡喃糖苷和薯蓣皂苷，共4种薯蓣皂苷。
2.2 2%红细胞悬液的制备取家兔新鲜血液20 ml，放入盛有玻璃珠的三角烧瓶中振摇约10 min，除去纤维蛋白原，制成脱纤血液，加100 ml生理盐水摇匀，1 500 r·min-1离心5 min，除去上清液，反复用生理盐水洗至上清液无红色，将所得红细胞用生理盐水配制成压积为2%的红细胞混悬液，备用。
2.3 体外溶血的肉眼观察［4，5］取10 ml干净玻璃试管，编号并按顺序加入各种样品溶液，其中空白对照为生理盐水，阳性对照为蒸馏水。各管轻度摇动至均匀后，37℃水浴中孵育3 h，观察1～3 h内各管的溶血程度，以“+”表示完全溶血，“－”表示无溶血，“±”表示部分溶血。
2.4 分光光度法测定体外溶血［4，5］取10 ml干净玻璃试管编号并按顺序加入100 μl各种样品溶液，再加入900 μl生理盐水和1 ml 2%压积的红细胞混悬液，其中空白对照为1 ml生理盐水和1 ml 2%压积的红细胞混悬液，阳性对照为1 ml蒸馏水和1 ml 2%压积的红细胞混悬液，每个样品浓度4个平行。各管轻度摇动至均匀，37℃水浴中温孵3 h后，离心，1 500 r·min-1离心5 min，每管取上清250 μl于96孔板中，用酶标仪进行测定。以空白对照管为空白，对阳性对照管进行全波长扫描，以阳性对照管的最大吸光度（545 nm）为选定波长读取各管吸光度（A）值。
2.5 溶血率计算用下式计算各试验管的溶血率：
溶血率（%）= 试验管吸光度阳性对照管吸光度×100%
溶血率>5%表明出现了溶血，不宜应用于注射剂型［4，5］。