正交设计法优化野菊花中蒙花苷的提取工艺

　　2.2 色谱条件色谱柱：大连依利特ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱; 流动相：A相为甲醇，B相为2.5%冰醋酸水溶液，进行梯度洗脱，0～12 min，由85%～80%，12～15 min，由80%～72%，15～25 min，由72%～60%，25～40 min，由60%～45%，40～50min，由45%～5%，50～60 min为5%;流速：1 ml/min;柱温：35 ℃;进样量：20 μl;检测波长：326 nm。图1 蒙花苷标准品HPLC色谱图

　　2.3 标准品的制备精密称取蒙花苷标准品1.0 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得标准品原溶液，备用。蒙花苷标准品色谱图见图1。

　　2.4 线性关系的考察精密吸取蒙花苷标准原液0.5 ml，置于5 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。以此方法等比稀释3次。再吸取标准原液1 ml，置于5 ml容量瓶中，稀释至刻度，以此方法等比稀释2次。分别吸取上述溶液20 μl进样，在上述色谱条件下进行分析，以标准品质量浓度的对数为横坐标，峰面积的对数为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得蒙花苷回归方程为 Y=0.981 8X+10.522，R2=0.999 8，n=7。表明蒙花苷浓度范围在0.1 ～100 mg/L内，线性关系良好。

　　2.5 样品溶液的制备与含量测定 精密吸取提取液适量置于5 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，过滤。置于1 ml进样瓶中，每次进样20 μl，测定蒙花苷峰面积，代入回归方程，计算百分含量。样品色谱图见图2。图2 样品HPLC色谱图

　　2.6 结果根据以上实验方法测得蒙花苷质量分数，实验结果见表2，方差分析见表3。表2 正交实验L9(34)及结果表3 方差分析表以蒙花苷的提取质量分数之和为指标，由表1中我们可以发现，提取溶剂的优水平为A3，溶剂量的优水平为B2，提取时间的优水平为C3，提取次数的优水平为D3。因此，蒙花苷提取工艺的优组合为A3B2C3D3，即80%乙醇，按8倍药材质量的溶剂量，提取3次，每次3 h。各因素对提取效率的影响主次顺序为D>B>A>C。由于提取时间对提取效率影响不大，为减少多次实验对工作量的增加和试剂的损耗，故选取提取时间作为方差分析中的误差列。根据方差分析可以看出，在P<0.05的条件下，溶剂量和提取次数具有显著性意义，而提取溶剂对提取效率影响不显著。同时，发现提取时间3 h比2 h的提取效率提高的并不明显。为节约时间，最终确定优化方案为80%乙醇，按8倍药材质量的溶剂量，提取3次，2 h/次。

　　2.7 验证性实验为了检验实验结果的可靠性，选取优化方案进行重复实验。结果见表4。实验结果为蒙花苷的平均质量分数为2.87%。结果高于全部9个正交实验。由此我们可以得出，此优化方案具有较高的可靠性及合理性。表4 验证实验结果

　　3 讨论

　　已有文献报道采用比色法作为检测手段对野菊花总黄酮提取工艺的比较[3]，但总黄酮成分复杂，因此，比色法测定时干扰较多，并且无法确切了解野菊花中主要成分如蒙花苷的提取效率。由于HPLC法对中药成分能进行较好的分离，结果较可靠，故选取RP-HPLC法对野菊花中蒙花苷的提取工艺进行优化，提高其提取效率。本方法所用检测波长为蒙花苷的最大吸收波长，即326 nm;以甲醇与2.5%冰醋酸水溶液为两相溶剂进行梯度洗脱;结果表明，此方法对样品中蒙花苷的分离及含量测定具有满意的效果。

　　目前应用较为广泛的野菊花提取方法为回流提取法以及超声提取法[4]，本实验在应用单因素分析法考察了30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇以及超声提取法对提取效率的影响后，发现在70%乙醇的条件下，野菊花的提取效率较高;同时与超声提取相比，回流提取所需设备简单，价格便宜，有利于工业上推广。故选取回流提取法作为提取方法。正交实验结果表明，优化提取方案为80%乙醇，按8倍药材质量的溶剂量，提取3次，每次2 h。

【参考文献】
  　[1] 王 丹.药用植物野菊花的研究现状及发展前景[J].现代中药研究与实践，2007, 21(4): 59.

　　[2] 巴根那，吉林百乙，白玉霞，等.正交设计研究广枣总黄酮提取工艺[J].中成药，2000, 22(4): 253.

　　[3] 罗显华，郁建生.野菊花总黄酮的提取与纯化[J].食品科技，2008， 7: 179.

　　[4] 朱庆书，赵文英.超声提取野菊花中黄酮及其抑菌活性的研究[J].化学与生物工程，2008， 25(12): 72.