中药药理、中药免疫研究和中兽药研发工作. 当归不同药用部位水提液体外清除自由基作用研究
作者：华永丽，郭延生，邓红娟，程越山，曲亚玲，魏彦明
【摘要】 目的研究生当归、当归头、当归身、当归尾的水提取液体外对羟自由基(·OH)和氧自由基(O2-·)的清除作用。方法应用分光光度法测定不同当归水提液对Fenton反应产生的羟自由基(·OH)和邻苯三酚自氧化产生的氧自由基(O2-·)的清除能力。结果当归不同部位水提液在受试浓度范围内对羟自由基和氧自由基有明显的抑制作用，随当归及其不同部位水提液浓度的增加，抑制率明显升高，呈明显的量效关系，对羟自由基的清除能力依次为生当归>当归身≈当归头>当归尾，对氧自由基的清除能力依次为当归身≈生当归>当归头>当归尾。结论当归不同部位水提液体外均具有较好的清除自由基的作用，不同药用部位在清除氧自由基和羟自由基能力上表现不同。
【关键词】 当归; 不同部位; 水提液; 羟自由基; 氧自由基
Abstract：ObjectiveTo study the effect of water extracts of different parts of Radix Angelicae Sinensis on hydroxyl radicals and oxygen free radicals.MethodsThe inhibition rate of water extracts of different processed products of Radix Angelicae Sinensis on free radical in vitro were detected by spectrophotometry. ResultsThe results showed that water extracts from different parts of Radix Angelicae Sinensis in vitro had significant scavenging effects on hydroxyl radical. Furthermore , the extracts exhibited a significant concentration-dependent elimination. ConclusionThe water extracts from different parts of Radix Angelicae Sinensis have significant antioxidative actions in vitro. There exist significant differences among these different parts of Radix Angelicae Sinensis on scavenging hydroxyl radical and oxygen free radical.
Key words： Radix Angelicae Sinensis; Different parts; Water extracts; Hydroxyl radicals; Oxygen free radical
当归为伞形科当归属植物当归Angelica sinesis (Oliv.)Diels.的干燥根，主产于甘肃岷县等地，属甘肃道地药材，是中(兽)医临床常用药，性温，味甘、辛，具有补血活血、调经止痛、润燥滑肠等功效[1]。中医药传统理论和临床经验认为，当归不同药用部位具有不同的药效。现代药理研究表明，当归在心血管系统、血液系统、免疫系统、抗损伤及保护方面均显示良好的药理作用，且具有一定的抗氧化和清除自由基的作用，对脑缺氧、缺血后再灌注脑组织脂质过氧化增高具有明显的抑制作用[2]，而中药抗氧化的作用机制是清除机体在正常细胞代谢中产生的超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢、单线态氧等自由基[3]。为此,本实验分别以超氧阴离子和羟自由基为检测指标，研究当归不同药用部位抗氧化作用的异同，以期从生物学角度探讨当归不同药用部位入药的依据。
1 材料与仪器
1.1 药物和试剂生当归采于甘肃岷县(经甘肃中医学院中药学系龙全江副教授和甘肃农业大学动物医学院中兽医教研组鉴定为伞形科当归属植物当归)，取原药材，除去杂质，洗净，润透，分头、身、尾切成薄片，晒干或低温干燥。无水乙醇、FeSO4·7H2O、水杨酸、H2O2、邻苯三酚、盐酸、L-抗坏血酸等均为分析纯;三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)为进口上海中秦化学试剂有限公司分装。
1.2 仪器RE-6000旋转蒸发仪(上海亚荣)，TBZ5-WS多管架自动平衡离心机(湘仪)，HH-501超级恒温水浴箱，OPPON-3000型紫外/可见光分光光度计(韩国)，CW-2000型超声-微波协同萃取仪，AL104电子分析天平，SHB-III循环水式多用真空泵，C型玻璃仪器气流烘干器，XW-80型旋涡混合器等。
2 方法
2.1 当归水提液制备分别取生当归、当归头、当归尾、当归身各100 g，加蒸馏水300 ml，85 ℃超声-微波协同提取2次，每次30 min。合并两次提取液，减压浓缩至质量浓度1 g/ml。4 ℃保存备用。
2.2 羟自由基体系参照Fenton反应的方法建立反应体系模型[4,5]，采用固定反应时间法[6,7]，在相同体积的反应体系(6 mmol/L的H2O2 1 ml，6 mmol/L的Fe2+ 1 ml，6 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液 1 ml)分别加入不同浓度的生当归、当归头、当归尾和当归身水提液1 ml，设置5个浓度组(质量浓度分别为5，10，20，40，80 mg/ml)，每个浓度设10个平行管。以蒸馏水为参比，在510 nm处测量各浓度下的吸光度，通过公式计算其清除率。以L-抗坏血酸为阳性药物对照，质量浓度分别为0.15，0.20，0.25，0.30，0.35 mg/ml共5个浓度组，每个浓度设10个平行管。
公式：清除率(%)=[Ai-(Aj-Ad)]/Ai×100%
Ai为空白对照液的吸光度;Aj为加入药物溶液后的吸光度;Ad为不加显色剂H2O2药物溶液本底的吸光度。
2.3 氧自由基体系[8,9]采用邻苯三酚自氧化法[10～12]：邻苯三酚在弱碱性介质中自氧化分解产生O2-·，利用O2-·清除剂能使邻苯三酚自氧化产物在325 nm处的吸收峰受到抑制这一特点设计实验，实验分为对照管和加药管，对照组管设5个平行管，分别加入50 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.2，含1 mmol/L 二乙基三氨基五乙酸)4.5 ml，加入4.2 ml双蒸水，混匀后25 ℃水浴保温20 min，取出后立即加入25 ℃水浴中预热的6 mmol/L的邻苯三酚0.3 ml (以10 mmol/L HCl代替邻苯三酚作为空白)，混匀后立即倒入比色杯，于325 nm处每隔30 s测A值1次，共测5 min，计算对照管溶液吸光度随时间的变化率。加药组设5个平行管，在加入邻苯三酚前先加入1.0 ml当归提取液(设质量浓度分别为25，50，100，200 mg/ml共4个浓度梯度)，再加入3.2 ml双蒸水，混匀后25 ℃水浴保温20 min，取出后立即加入在25 ℃水浴中预热的6 mmol/L邻苯三酚0.3 ml，混匀后立即倒入比色杯，于325 nm处每隔30 s测A值1次，共测5 min，计算当归及其炮制品水提取液吸光度随时间的变化率。以空白管标零。以L-抗坏血酸为阳性药物对照，设质量浓度分别为0.02，0.04，0.08，0.16 mg/ml共4个浓度组，每个浓度设5个平行管。
公式：清除率(%)=(⊿A-⊿A0)/⊿A×100%
⊿A：表示对照管邻苯三酚自氧化变化速率;⊿A0：表示加药管邻苯三酚自氧化变化速率)便能测定被测物对O2-·的清除作用。
2.4 数据统计处理用SPSS13.0统计软件进行方差分析、回归分析和线性相关，测定结果以±s表示，以(P<0.05)为检验水准。
3 结果
3.1 当归不同药用部位水提液对羟自由基的清除作用由表1可以看出当归不同部位水提液在不同实验浓度范围内都表现出不同的对羟自由基清除能力(P< 0.05)，随着不同当归水提液浓度的增加，抑制率明显增加，表明均呈明显的量效关系(r值分别为生当归0.971、当归头0.960、当归身0.946、当归尾0.961，P< 0.05)。由表3可以看出不同药用部位IC50从小到大依次为生当归、当归身、当归头、当归尾，即生当归水提物对羟自由基的清除能力依次为生当归>当归身≈当归头>当归尾。表1 当归不同部位水提液对羟自由基的清除作用
3.2 当归不同药用部位水提液对氧自由基的清除作用由表2可以看出当归不同部位水提液在不同实验浓度范围内都表现出不同的对氧自由基清除能力(P< 0.05)，随着不同当归水提液浓度的增加，抑制率明显增加，表明均呈明显的量效关系(r值分别为生当归0.983、当归头0.946、当归身0.915、当归尾0.926、，P< 0.05)。由表3可以看出不同药用部位IC50从小到大依次为当归身、生当归、当归头和当归尾，即生当归及其炮制品水提物对氧自由基的清除能力依次为当归身≈生当归>当归头>当归尾。