龙胆碱对高热惊厥模型大鼠脑内氨基酸类神经递质含量及海马区GABAB、Glu受体的影响
作者：姚素媛，刘学伟，刘树民
【摘要】 目的通过对脑内类氨基酸含量的及相应受体的测定，推测龙胆碱对脑损伤保护作用的可能机制。方法21日龄Wister大鼠100只，经筛选后随机分为空白对照组、模型组(FS组)、龙胆碱高剂量组(GT1组)、龙胆碱低剂量组(GT2)，热水浴法诱导高热惊厥模型，采用茚三酮染色法，借助全自动生化分析仪，计算脑组织氨基酸含量：氨基酸含量(mg/g湿组织)= 每20 μl上清液中氨基酸的含量/20×上清液总量(μl)/脑组织湿重(g)。免疫组化法观察海马区GABAB、Glu受体蛋白表达变化。结果GT各组大鼠脑组织中Glu含量高于模型组，GABA含量低于FS组，Asp 、Gly与FS组无显著性差异。GT1、GT2与FS组相比，差异具有显著性(P<0.05);GABA蛋白表达，GT1、GT2组在海马CA1 ～ CA3区GABAB蛋白表达明显高于FC组，但低于对照组，差异具有显著性;Glu各组间比较，差异均无显著性。结论龙胆碱对惊厥所致的脑损伤的保护作用机制与脑内神经递质GABA、Glu改变有关，GABA递质的增高与GABAB受体的相应增加是其作用的机制之一。
【关键词】 龙胆碱; 高热惊厥; 神经递质
Abstract：ObjectiveTo study possible mechanisms of the protective effects on brain damage of gentianine. Methods21-day old wistar rats were randomly divided into 4 groups: Normal control group(n=15),FS group(n=20),gentianine high-dose group(GT1 group,n=20), gentianine low-dose group(GT2,group.n=20). Automatic amino acid analyzer was used to observe the content changes of exactatory-inhibitory amino acid neurotransmitters (Glu,Asp, GABA, Gly)，and protein expression of GABABR, Glu receptor in hippocampus were detected by immunohistochemistry. ResultsThe contents of GABA in the GT1、GT2 group were those of glu were lower FS group ,the difference was significant between GT1、GT2 groups and FS group but the contents of Asp, Gly had no significant difference from FS group. The reslut of GABABR showed that the expression of GABAB was higher than FS group but lower than NG group in the GT1 .GT2 group ,and the difference was significant,but the GluR had no significant difference.ConclusionThe protective effect on the damage of brain of gentianine is related to the change of GABA and Glu contents in the rat brain, one of pharmacological mechanism on brain damage protection of gentianine is to increase the protein expression of GABABR and the content of GABA and decrease the contents of Glu in brain
Key words： Febrile Convulsions; Gentianine; Brain damage; Neurotransmitter
频繁或长时间高热惊厥发作可以造成婴幼儿中枢神经系统损伤，并对远期的惊厥易感性、学习记忆功能造成影响[1～3]。既往研究表明,高热惊厥的发生与脑内神经递质的改变密切相关，尤其是Glu介导的“神经毒”及 Glu与GABA平衡失调在惊厥的发生与脑损伤的形成过程有着更加紧密的相关性。GABAB亚单位表达的改变可能是上述损害的病理基础之一[4]。因此，开发有效的防治惊厥药物有较大的意义。龙胆碱为龙胆中获取的一种活性成分，前期研究结果表明，龙胆碱具有一定的对抗惊厥及脑保护作用[5]，但作用机制尚不明了，此种作用是否与脑内神经递质的改变有关?是否与脑内相关的受体改变有关?本实验证实了这一过程。
1 材料
21日龄Wistar 大鼠100只，雌雄各半，体质量(50±20)g(上海斯莱克实验动物有限责任公司),许可证号为：SCXK(沪)(2003-006)。参考文献的分组、造模及给药方法，复制实验模型[2，5]。
2 方法
2.1 脑组织匀浆液的制备鼠末次惊厥后24 h，每组随机抽取10只样本，以20%乌拉坦腹腔注射麻醉，剖胸暴露心脏，经左心室-升主动脉插管，0.9%生理盐水灌注30～50 ml，在枕骨大孔处迅速剪断延髓，去颅骨，取出脑组织，置于冰冷平皿中。切取一侧脑组织，在蒸馏水中洗净，滤纸拭干，电子天平精确称重。迅速将其放入预先盛有5 ml冰冷10%磺基水杨酸的玻璃匀浆器中，用冰冷10%磺基水杨酸以2 ml/g定容(湿重)，匀浆3 min，低温高速离心机(10 000×)冷冻离心15 min，沉淀变性蛋白，上层透亮液即含有4种氨基酸。取0.5 ml上清液，用针头式滤器(0.45 μl)过滤样品，在L-8800型日立氨基酸分析仪上进行Glu，Asp，GABA，Gly测定。进样量为20 μl，缓冲液流速为0.4 ml/min。所有操作保证在冰上或冰浴中进行。
2.2 免疫组化标本的制备每组中随机取7只大鼠，末次惊厥24 h 后，用20%乌拉坦麻醉生效后固定大鼠，切开胸腔，暴露心脏，剪开右心耳，穿刺针经左心室穿至主动脉，0.1 MPBS缓冲液缓慢灌流冲洗至流出液清亮，肝脏转呈灰白色，再予4%多聚甲醛缓冲液(4℃预冷，pH值7.4)约50 ml心脏灌注，四肢及尾部出现肌肉震颤表示灌注成功。于冰上断头开颅，取双侧大脑半球置于4%多聚甲醛中后固定24 h后，常规石蜡包埋，做冠状位切片厚10 μm，免疫组织化学染色镜检，GABAB抗体购自DBT公司，免疫组化染色试剂盒为博士德公司产品，DAB显色，中性树脂封片阴性对照采用PBS代替一抗，阳性对照为同一切片已知阳性核团自身对照。
2.3 数据处理应用SPSS14.0软件进行统计处理，数值以 ±s表示。各组间差异，用均值间两两比较，采用t检验。免疫组化方法与黄色为阳性反应颜色，显微镜下观察比较海马区阳性反应的着色程度。在40×显微镜下采用双盲半定量评估：每实验组中每个标本随机切取8张切片，每张切片在40×显微镜下随机选取8个视野,按每个视野阳性细胞数百分比进行计算，每组所有切片所有视野的百分比的平均值粗略计为该组的阳性表达值。评估标准[6]为：(-);0～25(+);26～50(++);51～75(+++);76～100(++++)。
3 结果
3.1 脑组织各氨基酸类神经递质的含量测定结果见表1表1 脑组织氨基酸类神经递质的含量变化(ng/g脑湿重
3.2 免疫组化结果
3.2.1 对照组GABAB受体散在分布于海马CA1～A3区的锥体细胞、齿状回的颗粒层和大脑皮层，棕色，强度为(+++)。FS组大鼠海马GABAB蛋白表达低于对照组。强度为(+～++)，在CA1～CA3区下降更明显。GT1、GT2组大鼠海马CA1～CA3区的GABAB蛋白表达亦低于对照组，但高于模型组，染色为棕色，强度为(++～+++)。GT1、GT2组间无显著性差异，染色为棕色。GABAB各组免疫组化染色结果图2。
3.2.2 对照组Glu受体散在分布于海马CA1～A3区的锥体细胞、齿状回的颗粒层和大脑皮层，色为深棕色，强度为(++)。FS组大鼠海马Glu蛋白表达高于对照组。强度为(+++)， GT1、GT2组大鼠脑内各区的Glu蛋白表达与对照组均无显著性差异，与模型组比较亦无显著性差异，染色为黄色，强度为(+++)。GT1、GT2组间无显著性差异。Glu各组免疫组化染色结果见图3。
A氨基酸对照品 B空白组 CFS组 DGT1组 EGT2组
图1 脑组织各氨基酸类神经递质分析图谱
A空白组 BFS组 CGT1组 DGT2组
图2 GABAB各组免疫组化图
A空白组 BFS组 CGT1组 DGT2组
图3 谷氨酸各组免疫组化图
4 讨论
谷氨酸(Glu) 、天门冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)和γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统重要的递质。Glu与Asp为兴奋性氨基酸，在学习与记忆、神经元损伤等生理和病理生理过程中起着关键作用，而Gly、GABA在中枢神经系统主要起抑制性作用。以Glu为代表的兴奋性氨基酸是中枢神经系统最为重要的兴奋性氨基酸(EAA)。其作用是通过激动NMDA受体和非NMDA受体完成的，涉及学习、记忆、癫痫、疼痛以及兴奋性损伤等的过程。大量证据表明，Glu递质释放后通过激活NMDA受体，诱导LTP的形成，从而对学习记忆行为进行调节。另一方面，脑内Glu及类似物水平过高可产生神经毒性，对脑功能有不利影响。正常情况下的兴奋性氨基酸神经递质在病理条件下产生神经毒性而导致神经元死亡的现象，称为“兴奋毒性”。“兴奋毒性”损伤是惊厥性脑损伤的重要机制之一，惊厥时脑内Glu含量增加，Glu对神经元有很强的兴奋毒性作用[7]，高浓度的Glu可激活谷氨酸受体，导致Ca2+ 大量内流，神经元内Ca2+ 超载，从而诱发一系列的钙促反应，产生不可逆的细胞损伤，造成神经元变性坏死。
脑组织中GABA、Gly是主要的抑制性氨基酸(IAA)。对于GABA在学习记忆中的作用尚存在不一致的看法。作为脑内最重要的抑制性氨基酸，GABA对EAA所引起的“兴奋毒性”有明显的拮抗作用[8]。GABA由谷氨酸脱羧而成，谷氨酸在谷氨酸脱羧酶(GAD)作用下产生大量的GABA，后者可负反馈地抑制谷氨酸释放，以减少由于谷氨酸大量释放所造成的脑损伤。同时，由于二者在代谢上这种密切的联系，Glu和GABA的比值反映了一定的功能状态。
本实验前期实验的基础上，对各组大鼠脑组织中氨基酸类神经递质Glu、Asp、GABA、Gly的含量测定表明，惊厥大鼠的Glu显著升高，GABA的含量显著降低;Asp、Gly虽也有相应的改变，但并不明显，推测与抗惊厥作用关系不大。龙胆碱高、低剂量组明显下调高热惊厥大鼠兴奋性神经递质Glu的含量(P﹤0.05)，并能上调抑制性神经递质GABA的含量(P﹤0.05)。推测龙胆碱能通过调节脑内GABA、Glu二者的平衡，达到控制惊厥的发生、缓解脑损伤程度的目的。同时，免疫组化结果表明，GABAB的受体蛋白表达增加，可能是机体的一种应激性改变，Glu的蛋白表达未见明显的差异性改变，说明Glu仅限于递质的增加，而未伴随着相应的受体改变。综上分析可知，龙胆碱上述作用与脑内GABA关系更加密切，下调脑内GABA含量、刺激相应的受体增加，可能是其发挥抑制惊厥发生、缓解脑组织损伤作用的机制之一。由于条件所限，我们未能对GABA的两个亚型进行更深入的探讨，因此，不能进一步明确二者与本作用的关系，仍需更加深入的研究。
【参考文献】
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