金银花水提取液抗氧化作用研究
【摘要】 目的研究金银花提取液在体外对H2O2、·OH、O2-·的清除作用。方法用超声波处理和直接水煮制备金银花水提液，采用碘量法、番红褪色光度法和NBT法分别测定两种水提液对H2O2、·OH和O2-·的清除作用。结果两种提取液均对H2O2的清除作用较弱，但具有浓度-效应关系;超声波处理的提取液对·OH的清除作用随提取液浓度的增加而增强，水煮处理的提取液中以1∶50的浓度对·OH的清除作用最强;二者对O2-·有较强的清除作用，且作用的趋势和能力一致，在加入量不超过250 μl时，其清除率随加入量的增加呈线性上升，以后基本不再增加。结论金银花水提液对·OH和O2-·具有较强的清除作用，可作为抗氧化剂进一步开发。
【关键词】 金银花; 水提液; 超声波; 抗氧化
体内最重要的一类自由基是氧自由基，包括O2-·、·OH、H2O2、H O-2、1O2、ROO·、RO·等。[1]，在正常生理状态下，机体内自由基的产生与清除处于动态平衡。如果自由基产生过多或清除过慢时，它将通过攻击生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的损伤[2]。因此探求天然的自由基清除剂对于保护人体健康极为有益。
金银花是药食两用植物，主要含有绿原酸、类黄酮等生理活性成分，中医认为金银花具有清热解毒等诸多功效，它的化学成分、药理作用及其安全性等均被广泛关注，研究结果时有报道[3]，但对其抗氧化作用的研究不多，而且目前主要针对的是金银花对油脂氧化的抑制作用[4～6] 。本文以传统的水煮水提液和现代化的超声波处理金银花所得水提液作为样本，考察它们对O2-·，·OH，H2O2的清除作用，从而评价金银花的抗氧化能力，对金银花的开发利用具有积极意义。
1 材料
1.1 材料、试剂与仪器供试材料金银花购于重庆普通超市。
番红花红T，上海化学试剂采购供应站;氯化硝基四氮唑兰(NBT)，前进试剂厂;核黄素(VB2)，上海化学试剂站分装厂;L-甲硫氨酸(Met)，上海康达氨基酸厂;硫代巴比妥酸(TBA):上海试剂二厂;其余试剂均为分析纯。
KQ5200型超声波提取仪，昆山市超声仪器有限公司;ZFQ-S旋转蒸发器，天津玻璃仪器厂;UV-2405紫外可见分光光度计，日本岛津。
1.2 金银花提取液的制备
1.2.1 超声波处理金银花提取液的制备取一定量的金银花用去离子水泡24 h后，在20 kHz的超声仪中处理40 min，控制温度为40℃。过滤，用旋转蒸发仪蒸发浓缩，定容到每毫升提取液相当于0.2 g(1∶5)金银花干品。
1.2.2 金银花水煮提取液的制备取一定量的金银花用水煮提3次，第1次60 min，过滤，又加水煮提40 min，过滤，再加水煮提30 min，过滤。合并滤液，用旋转蒸发仪蒸发浓缩，定容到每毫升提取液相当于0.2 g(1∶5)金银花干品。
2 方法
2.1 对H2O2的作用采用碘量法[7]测定。每个样品做3次平行样，取其平均值。计算：H2O2清除率E(%)= V1-V2V1-V0×100%式中：V0——阴性对照消耗Na2S2O3的体积(ml);V1——阳性对照消耗Na2S2O3的体积(ml);V2——样品消耗Na2S2O3的体积(ml)。
2.2 对·OH的作用主要根据文献[8]进行。羟自由基由EDTA Na2-Fe(II)-H2O2体系产生。由于·OH可特异性地使番红花红T褪色，可根据褪色程度衡量·OH的生成量。每个样品做3次平行样，取其平均值。计算·OH的清除率E(%)=(A2 - A11)/(A1 -A11)×100%式中：A2——样品的吸光度;A11——溶剂的吸光度;A1——对照组的吸光度。
2.3 对O2-·的清除作用利用核黄素(VB2)在光激发下产生O2-·，O2-·可使氮蓝四唑(NBT)还原生成蓝色的甲基臜[9]。当O2-·被清除，可抑制NBT的还原，其吸光度值降低。清除能力越强，吸光度就减少得越多。每个样品做3次平行样，取其平均值。计算：O2-·清除率E(%)= (A1-A11)-(A2-A21)A1-A11×100%式中：A1——对照组的吸光度;A2——样品组的吸光度;A11——空白1的吸光度(空白1不加样品);A21——空白2的吸光度(空白2加样品但不加pH 7.8的PBS)。
2.4 绿原酸含量的测定用分光光度法[10]进行测定。所得标准曲线的回归方程是：Y= 0.128 3 + 0.022 7X，r2 = 0.996 7
2.5 总黄酮含量的测定用芦丁做标准，分光光度法测定[11]。所得标准曲线的回归方程是：Y= 0.001 2 + 0.035 8X，r2= 0.999 9
3 结果与分析
3.1 金银花水提液对H2O2的作用所有能产生O2-·的生物体系都能通过歧化反应产生H2O2。H2O2能使少数酶的-SH基氧化失活，能迅速穿过细胞膜;在有过渡金属离子(如Fe2+或Cu+)存在时，发生典型的Fenton反应，生成·OH[12]。·OH是化学性质最活泼、毒性最大的活性氧[13]。在反应体系中对H2O2具有清除作用，就可能抑制H2O2对机体的不利影响。在取样量为10 ml时，超声波处理的和直接水煮的金银花水提液对H2O2清除作用的实验结果见表1。
由表1可知，超声波处理的和直接水煮的金银花水提液对H2O2的清除作用随浓度的增加而增加，但增加的幅度较小且清除能力非常弱 表1 金银花提取液对H2O2的作用
3.2 金银花水提液对·OH的作用·OH是毒性最大的活性氧，对细胞内DNA的破坏作用最大[14]，它可以形成碱基自由基。生成的这些嘧啶和嘌呤自由基可以相互结合，或再通过其它自由基反应生成过氧化物，这些变化可造成碱基的破坏，从而产生遗传突变。在取样量为1.0ml时，超声波处理的和直接水煮的金银花水提液对·OH作用的实验结果见表2。表2 金银花提取液对·OH的清除率%
由表2可知，超声波处理的金银花水提液对·OH的清除作用是随浓度的增加而增强，当加入1∶20的提取液1.0 ml，对实验体系中·OH的清除率可达100%。而水煮得的金银花水提液当浓度低于20 mg/ml(1∶50)时，随浓度的增加对·OH的清除作用增强，然而当浓度再增加，它们对·OH的清除作用反而减弱，当提取液的浓度达到50 mg/ml(1∶20)其清除率为0。本实验分析了这两种提取液中绿原酸和总黄酮的含量，结果见表3。由表3可知，两种提取液中绿原酸的含量无明显差别，但总黄酮的含量差别较大，超声波处理的金银花水提液中总黄酮的含量较高。是它们之间黄酮含量的差别导致对·OH的清除作用的差异还是其它成分在起作用有待进一步研究。
表3 金银花提取液中绿原酸和总黄酮的含量μg·ml-1以直接水煮得到的金银花水提液中对·OH的清除作用最强的1∶50的提取液为研究对象，考察不同的加入量对·OH的清除作用，实验结果见图1。图1 1∶50的金银花水提液对·OH的清除作用由实验结果可知，当加入量不超过0.7ml时，该提取液对·OH的清除率随加入量的增加呈线性上升，达到78.26%后，随提取液加入量的增加，清除率的增加就非常缓慢。