N软脂酰基壳聚糖的制备及其改善靛玉红水溶性的药动学研究
作者：王来友 蒋刚彪 方羽生 巫玮 臧林泉 曾明华
【摘要】 目的 制备N软脂酰基壳聚糖（PLCS）纳米胶束，改善难溶性药物靛玉红的溶解性与生物利用度。方法 首先使用溶胀的壳聚糖与软脂酸酐在二甲基亚砜溶剂中反应合成水溶性的PLCS，通过IR和1HNMR表征PLCS的结构；然后用其负载靛玉红，以激光散射和透射电镜检测载药纳米胶束的物理特征,用HPLC法测定其包封率。最后进行载药纳米胶束腹腔注射给药后在大鼠体内的药动学实验,与靛玉红混悬剂对照。结果 合成得到的PLCS能很好地负载并增溶靛玉红，载药率可达10%左右。药动学研究表明，用PLCS载靛玉红后较靛玉红混悬剂的AUC提高了2.21倍，显著提高了靛玉红在大鼠体内的生物利用度。结论 PLCS可作为提高难溶性药物靛玉红生物利用度的有效载体，进而可能改善靛玉红治疗白血病的疗效。
【关键词】 靛玉红 N软脂酰基壳聚糖 纳米胶束 药动学
从青黛等中药中提取的靛玉红在白血病治疗中已显示出独特的优势，它既能有效破坏白血病细胞，又对正常骨髓无明显抑制作用。然而靛玉红的水溶性很差，不利于被吸收，生物利用度非常低；同时，它对胃肠道黏膜有很强的刺激作用。吴正红等［1］认为可通过增加靛玉红的溶解度以提高其生物利用度，在剂型设计上要以提高靛玉红的溶解度为中心。目前，通过对壳聚糖表面进行修饰并利用其做为药物载体，是新型水溶性制剂研究的前沿阵地［2］。Sirica A E等［3］曾报道壳聚糖本身对白血病癌细胞具有选择性聚集作用，而且壳聚糖及其衍生物对白血病癌细胞也有较强的抑制作用［4］。因此，本文采用壳聚糖分子接枝软脂酰基，制备N软脂酰基壳聚糖（PLCS）来增溶控释靛玉红，以提高靛玉红的生物利用度和降低其对消化道的毒副作用，并发挥壳聚糖衍生物纳米粒子作为抗白血病药物载体所具备的独特优势。
1 材料与方法
1.1 试剂、药品与仪器
壳聚糖（分子量45 kDa，脱乙酰度为95％，上海博奥生物科技公司），软脂酸、乙酐（广州化学厂），HPLC用甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯，靛玉红（自提取，纯度95％以上）。
LC10AT 高效液相色谱仪(shimadzu,Japan)， Nicolet 670 FTIR红外光谱仪(Thermo Nicolet,USA)， Mercure plus 300 MHz 1HNMR 核磁共振仪（Varian,USA），BI200SM goniometer激光散射仪(Brookhaven,USA)， JEM2010电子显微镜(JEOL,Japan)， IEC Micromax Microentrifuge(Thermo Electron corporation,USA)。
1.2 PLCS的合成与聚合物结构表征
1.2.1 PLCS的合成方法 参考Hirano等［5］的方法:2.0 g（0.012 moL）壳聚糖（脱乙酰度95%）溶解在100 mL 0.1 mol/L的稀乙酸中，再以0.2 mol/L NaOH溶液沉淀，过滤，蒸馏水洗涤到pH值接近7，沥干水分，分散到100 mL二甲基亚砜（DMSO）中，磁力搅拌下升温至60 ℃，缓慢滴加0.024～0.048 moL软脂酸酐，保温反应8 h结束反应，加入丙酮沉淀产物，过滤，滤渣依次用丙酮和乙醚洗涤多次，除去软脂肪酸和软脂酸酐，产物60 ℃下真空干燥，产物的取代度(DS)定义为壳聚糖分子中每100个糖环中所引入的脂肪酰基个数，用酸碱滴定以及1HNMR法测定。
1.2.2 PLCS聚合物结构表征
1.2.2.1 FTIR分析 以KBr压片，用Nicolet 670 FTIR红外光谱仪测定。
1.2.2.2 1HNMR分析 以Mercure Plus 300 MHz spectrometer核磁共振仪在室温下测定，以氘代DMSO(DMSOd6)为溶剂（TMS内标），试样质量浓度约为3%。
1.2.2.3 空白纳米胶束制备和胶束性能检测 用直接溶解法制备胶束，称取一定量的PLCS置小烧杯中，量取一定体积的二次蒸馏水（经0.5 μm滤膜过滤处理）倒入烧杯中，用普通超声仪震荡3次（每次10 s），可看到PLCS逐渐溶解，除液面有少许泡沫外，溶液基本澄清。再用触点超声仪震荡3次(每次5 s )，此时液面产生大量泡沫，但不久泡沫消散得澄清溶液，即得到PLCS胶束溶液，用光电笔穿透照射溶液，可观察到明显的光路，即溶液有明显的丁达尔现象。
用动态光散射方法测定胶束的水动力学半径( hydrodynamic radii )和聚合物分散度。将按上述方法配制的PLCS水溶液倒入检测池中，以532 nm的激光垂直照射样品池，检测器与入射光的角度为90°。
在以透射电镜（TEM）检测胶束粒子之前，胶束纳米粒子先通过甲胺钨酸盐染色：取按“3.2.1”项的方法配制的PLCS水溶液12滴，滴在200目表面镀了碳膜的铜网上，自然干燥5 min后，以滤纸轻轻吸干铜网上的液珠，然后把铜网浸泡在甲胺钨酸盐的缓冲溶液中，染色1 min，再在清水中漂1～2次，室温下晾数分钟，在电镜下观察纳米胶束的粒径和形貌。
1.3 靛玉红PLCS纳米胶束的制备与载药量测定
准确称取多份靛玉红(每份约200 mg)置小三口瓶中，依次倒入15 mL二氯甲烷、10 mL丙酮，磁力搅拌使靛玉红完全溶解，然后加入PLCS(DS 14. 2) 200～1 000 mg,继续磁力搅拌，此时PLCS不溶解，随后缓慢滴加15～30 mL双蒸水，随着双蒸水的不断加入，PLCS逐渐溶胀、溶解并逐渐聚集形成胶束缠绕负载上靛玉红。混合溶液继续搅拌12 h，挥发有机溶剂后，冷冻干燥得载药粉末。用大量二氯甲烷反复浸泡和淋洗没有负载上的以及黏附在PLCS粉末表面的靛玉红，通过配制标准溶液和绘制标准曲线，用HPLC法检测没有被PLCS负载的靛玉红的质量，根据公式LC=(A-B)/C ［6］ （A=投入靛玉红的总质量; B=没有被负载靛玉红的质量; C=投入PLCS的质量）计算PLCS对靛玉红的载药量。
1.4 载靛玉红PLCS纳米胶束在大鼠体内的药动学
1．4．1 色谱条件 色谱柱：Angilent Hypersil ODS(4.0 mm×250 mm,5 μm)；流动相：甲醇水乙酸（体积比74∶25∶1）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：287 nm；进样体积：20 μL。
1．4．2 给药方案与血样采集与处理 将雄性SD大鼠（约300 g,购自广东省医学实验动物中心，合格证号：粤监证字2007A006）16只，随机分成2组，分别按体质量1.25 mL·100 g-1灌胃0.80 mg·mL-1靛玉红混悬液(精密称取约8 mg靛玉红原料药，加1 mL DMSO充分混匀，加入10%吐温80溶液0. 5 mL，超声混合，双蒸水定容至10 mL)以及上述纳米胶束水溶液，注射前禁食12 h，可自由饮水。注射给药后分别于0、0.016、0.08、0.16、0.32、0.64、1、2、 4、6、10 h断尾取血0.5 mL置肝素化的离心管中，血样于3 000 r/min离心10 min，上层血浆样品处理方法及含量测定同文献［7］ 。
1.5 统计学处理
实验数据采用SPSS13.0软件进行student’s t检验，比较各组变量间有无差异。