HPLC-MS/MS法测定兔血浆中黄芪甲苷的含量
【摘要】 目的建立兔含药血浆中黄芪甲苷含量快速测定的新方法。方法固相萃取法富集血浆中的黄芪甲苷;Agilent SB-C18反相色谱进行分离;采用离子阱质谱多级反应模式，以m/z 807.5→627.1为选择离子对，内标法测定含量。结果血浆中黄芪甲苷的检测限为0.1ng/mL，线性范围为0.5～50.0μg/mL，平均方法回收率在96.3%～104.7%范围内。结论该方法具有灵敏度高、稳定性好和快速的特点，符合生物样品的分析要求，有望用于黄芪甲苷的药代动力学研究。
【关键词】 黄芪;黄芪甲苷;固相萃取;HPLC-MS/MS
ABSTRACT: ObjectiveTo establish a new method for the determination of astragaloside Ⅳ in rabbit plasma by high performance liquid chromatography-ion trap mass spectrometry (HPLC-MS/MS).MethodsAstragaloside Ⅳ in plasma samples was enriched by solid phase extraction. The resulted samples were further separated by reverse phase chromatography with Agilent SB-C18 column. Multiple reaction mode of MS/MS was employed to determine the concentration of astragaloside Ⅳ by internal standard with m/z 807.5→627.1 as the selected ion pair.ResultsThe detection limit of astragaloside Ⅳ in plasma samples was 0.1ng/mL, the linear range was 0.5-50.0μg/mL, and the average recovery rate of the method was within the range of 96.3%-104.7%. ConclusionThe proposed method has the characteristics of high sensitivity, good stability and high speed. These properties can meet the requirements of the analytical method for biological samples, which indicates that the method may be used in pharmacokinetic study of astragaloside Ⅳ.KEYWORDS: Radix Astragali; astragaloside Ⅳ; solid phase extraction; high performance liquid chromatography-ion trap mass spectrometry (HPLC-MS/MS)
黄芪为中医临床广泛应用的益气中药之一，味甘、性温，具有补气固表、脱毒和利尿等功效。中华人民共和国规定临床所用黄芪药材为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根[1]。黄芪甲苷为黄芪的主要有效成分之一，其含量测定方法主要包括薄层扫描法[2]和以紫外[3]和蒸发光散射[4]为检测方法的高效液相色谱法。由于黄芪甲苷为紫外末端吸收物质，上述方法虽能用于黄芪药材及制剂中黄芪甲苷的含量测定，但灵敏度方面难以满足生物样品中黄芪甲苷的测定要求。本文采用固相萃取法对兔含药血浆中的黄芪甲苷进行富集，高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS/MS)进行分离测定，旨在建立可用于黄芪甲苷药代动力学及在其他生物样品中含量测定的新方法。
1材料与方法
1.1药品与试剂黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所)，地高辛对照品(中国药品生物制品检定所)。黄芪药材购自陕西省中药材公司，经陕西省药品检验所鉴定为蒙古黄芪。乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)，水为超纯水(自制)，其他试剂均为分析纯。
1.2仪器Agilent 1100系列液相色谱-离子阱质谱联用系统(含二元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱、电喷雾离子化接口、离子阱质量分析器及Agilent Chemstation 5.2控制软件包)。Alltech公司固相萃取仪;Agilent C18固相萃取柱(500mg，6cc，美国安捷伦公司)。
1.3实验动物新西兰大白兔，♀、♂各半，体重1.8～2.3kg，由西安交通大学实验动物中心提供，动物合格证号：陕医动字第082018号。
1.4固相萃取柱的活化方法取安捷伦公司C18(500mg，6cc)固相萃取小柱安装于固相萃取仪上，依次用10mL甲醇、20mL超纯水、10mL 600mL/L甲醇溶液洗脱活化。
1.5供试品溶液的制备
1.5.1黄芪甲苷对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品5.0mg，置10.0mL量瓶中，用甲醇溶解并定容稀释至刻度，制备成浓度为0.5mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液。
1.5.2地高辛对照品溶液的制备精密称取地高辛对照品3.0mg，置5.0mL量瓶中，用甲醇溶解并定容稀释至刻度，制备成浓度为0.6mg/mL的地高辛储备液。
1.5.3黄芪药材的提取称取黄芪药材20.0g，干燥至恒重，粉碎，过40目筛，准确称取药材粉末100.0g，加10倍量甲醇，冷浸过夜，超声提取3次，每次30min，滤过，合并滤液，减压浓缩后制成干膏，研磨成粉，以羧甲基纤维素钠悬浮，备用。
1.5.4空白血浆样品溶液的制备取兔混合空白血浆0.5mL，加入地高辛对照品溶液10μL，置于2.0mL离心试管中，加入20μL浓度为10.0mol/L的三氯乙酸溶液，5000r/min离心5min，取上清液通过已活化好的固相萃取小柱，先用3.0mL水洗脱，再用2.0mL甲醇洗脱。收集甲醇洗脱液，40℃氮气吹干，残渣用流动相溶解，0.45μm有机滤膜过滤，冷藏备用。
1.5.5含药血浆样品的制备新西兰大白兔3只，12h禁食不禁水，以黄芪甲苷剂量为2.0mg/kg(相当于每公斤4.0g药材)灌胃给予黄芪药材提取液。分别于给药后0、10、30和60min耳缘静脉取血1.5mL，肝素抗凝，离心制备血浆。取血浆0.5mL，加入地高辛对照品溶液10.0μL，置于2.0mL离心试管中，加入20.0μL浓度为10.0mol/L的三氯乙酸溶液，5000r/min离心5min，取上清液通过已活化好的固相萃取小柱，先用3.0mL水洗脱，再用2.0mL甲醇洗脱。收集甲醇洗脱液，40℃氮气吹干，残渣用流动相溶解，0.45μm有机滤膜过滤，冷藏备用。
1.6分析条件色谱柱为Agilent SB-C18柱(5μm，4.6mm×150mm);流动相为甲醇-5.0mmol/L乙酸水(75∶25，V∶V);流速为0.8mL/min;柱后2∶1分流，三分之一流出液进行质谱检测。质谱条件为：电喷雾正离子模式检测;雾化气压力为40.0psi;干燥气温度为325℃，流速为9.0L/min;黄芪甲苷选择m/z 807.4→627.2为离子对，地高辛选择m/z 803.5→m/z 785.1为离子对;质量扫描范围为100～1500amu。