一种新型海洋来源的蒽环类化合物D19抗肿瘤活性及机制研究
3.2.2D19作用后乳腺癌细胞中凋亡蛋白表达水平的变化
为进一步明确D19导致人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的分子机制，本文以时间梯度收MCF-7的总蛋白做Western Blotting。随着处理时间逐渐增加，caspase-9和PARP的前体逐渐减少，切割体逐渐增加(见图6)。α-Tubulin作为内参。结果显示，D19作用后的MCF-7细胞通过激活caspase诱导细胞凋亡。[PSa6696;S*2〗图6D19作用后人乳腺癌细胞MCF-7中caspase 9和PARP的表达水平变化Figure 6Time-dependent effect of D19 on caspase 9 and PARP in MCF-7
4讨论
肿瘤的化疗、放疗及生物学疗法是治疗肿瘤的重要手段，这些手段的主要机制在于利用化学药物、放射线或免疫制剂诱导肿瘤细胞发生凋亡。近年来研究一些抗肿瘤药物的作用机制时，除了研究其对DNA等大分子化合物合成及其结构的影响外[8]，还研究其对细胞凋亡的影响，发现抗代谢药物中的甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、Topo-I酶抑制剂喜树碱、Topo-II酶抑制剂鬼臼乙叉甙、阿霉素，以及顺铂、三尖杉酯碱、紫外线及γ-射线等，均可诱导细胞凋亡。因此认为细胞凋亡对肿瘤发生发展起着重要作用。如果对凋亡与抗肿瘤药物之间的关系进行深入研究，有可能改善目前肿瘤临床药物治疗的效果。
海洋作为一种特殊的生长环境(高盐、高压、缺氧、缺少阳光等)，使海洋生物能够产生并积累大量化学结构、生理活性与功能均十分特殊的物质，为此提供了一个丰富的新颖结构的化合物库 [9-12]。蒽环类化合物以阿霉素、表阿霉素为代表，具有抗肿瘤的生物活性[13-14]。本研究结果表明，从南海海洋共生微生物的次生代谢产物中筛选到的D19，具有蒽环类化合物的基本骨架。在体外实验中对人乳腺癌细胞表现出明显的抗肿瘤活性。值得注意的是，其对低分化、高侵袭性的乳腺癌细胞 MDA-MB-435 抑制率最高(IC50= 4.01 μmol/L)，对低致瘤率、低转移的人乳腺癌 MCF-7 抑制率稍低(IC50=7.32 μmol/L)。提示D19抑制肿瘤细胞生长的分子机制中可能存在对恶性肿瘤特异性的靶点。
目前认为，诱导细胞凋亡主要有caspase依赖途径和非caspase依赖途径，而以caspase依赖途径为主，caspase激活有外源性和内源性两条途径[15-18]。为了探讨D19的抗肿瘤作用分子机制，用 TUNEL 染色法分析了D19引起的细胞变化，发现该化合物能有效诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡。同时Western Blotting结果显示D19作用后，乳腺癌细胞中的凋亡蛋白如caspase 9及下游的效应蛋白PARP都发生裂解，说明D19能够诱导细胞通过caspase依赖的细胞凋亡而发挥抗肿瘤的活性。这一结果为深入研究D19 抗肿瘤活性的分子机制提供了线索。
【参考文献】
[1] 世界卫生组织秘书处报告.预防和控制癌症[R]. 第五十八届世界卫生大会，2005.
[2] AMADOR M L,JIMENO J,PAZ-ARES L,et al. Progress in the development and acquisition of anticancer agents from marine sources[J]. Ann Oncol,2003,14(11):1607-1615.
[3] HORTOBGYI G N. Anthracyclines in the treatment of cancer. An overview[J]. Drugs,1997,54(Suppl 4):1-7.
[4] CORTS-FUNES H,CORONADO C. Role of anthracy-clines in the era of targeted therapy[J].Cardiovasc Toxicol, 2007,7(2):56-60.
[5] 孙燕,谷铣之. 肿瘤综合治疗的原则和实践[J],中国肿瘤,1999,8:21-23.
[6] LI Jun,ZHANG Nu,SONG Li-bing, et al. Astrocyte elevated gene-1is a novel prognostic marker for breast cancer progression and overall patient survival[J].Clin Cancer Res, 2008,14 (11):3319-3326.
[7] 姜广策,林永成,周世宁,等. 中国南海红树内生真菌No.1403次级代谢物的研究[J].中山大学学报:自然科学版,2000,39(6):68-72.
[8] SKLADANOWSKI A,KONOPA J. Interstrand DNA crosslinking induced by anthracyclines in tumour cells[J].Biochem Pharmacol,1994,47 (12):2269- 2278.
[9] CART,B K. Biomedical potential of marine natural products[J].Bioscience, 1996,46(4):271-286.
[10] SCHEUER P J. Some marine ecological phenomena: chemical basis and biomedical potential[J].Science, 1990,248(4952):173-177.
[11] 胡艳红,张庆林,王正平. 海洋微生物生物活性代谢物研究进展及技术问题[J].科学技术与工程,2004,4(2):160-163 .
[12] 管华诗,耿美玉,王长云. 21 世纪中国海洋药物[J].中国海洋药物,2000,76 (4):44-47.
[13] PERCHELLET E M,MAGILL M J,HUANG X,et al. 1,4-Anthraquinone:an anticancer drug that blocks nucleoside transport,inhibits macromolecule synthesis,induces DNA fragmentation,and decreases the growth and viability of L1210 leukemic cells in the same nanomolar range as daunorubicin in vitro[J]. Anticancer Drugs,2000,11(5):339-352.
[14] KIM S G,SUNG M,KANG K W,et al. DA-125,a novel anthracycline derivative showing high-affinity DNA binding and topoisomerase Ⅱ inhibitory activities,exerts cytotoxicity via c-Jun N-terminal kinase pathway[J].Cancer Chemother Pharmaco,2001,47(6):511-518.
[15] IMAJOH M,SUGIURA H,OSHIMA S. Morphological changes contribute to apoptotic cell death and are affected by caspase-3 and caspase-6 inhibitors during red sea bream iridovirus permissive replication[J].Virology,2004,322(2):220-230.
[16] ZHANG Y,BHAVNANI B R. Glutamate-induced apoptosis in neuronal cells is mediated via caspase-dependent and independent mechanisms involving calpain and caspase-3 proteases as well as apoptosis inducing factor (AIF) and this process is inhibited by equine estrogens[J].BMC Neurosci,2006,7:49.
[17] MHLETHALER-MOTTET A,BALMAS K,AUDERSET K,et al. Restoration of TRAIL-induced apoptosis in a caspase-8-deficient neuroblastoma cell line by stable re-expression of caspase-8[J]. Ann N Y Acad Sci, 2003,1010(1):195-199.
[18] CHEEMA Z F,SANTILLANO D R,WADE S B，et al. The extracellular matrix,p53 and estrogen compete to regulate cell-surface Fas/Apo-1 suicide receptor expression in proliferating embryonic cerebral cortical precursors,and reciprocally,Fas-ligand modifies estrogen control of cell-cycle proteins[J].BMC Neurosci,2004(5):11.