补肾益精方延缓老年雄性大鼠骨与脑衰老的实验研究
内容提要 目的：评价补肾益精方延缓老年雄性大鼠骨衰老与脑衰老的作用，探讨此方延缓整个机体衰老的机制。方法：40只24月龄SD雄性大鼠随机分为24月龄本底对照组、30月龄增龄对照组、补肾益精方低剂量组、补肾益精方高剂量组，每组各10只。低剂量组、高剂量组均自24月龄给药至30月龄。各组相应处理以后分别测定各组大鼠的骨参数(左侧股骨近段、中段、远段的骨密度和右侧股骨的弯曲断裂载荷)以及脑参数(脑组织M受体结合容量和胆碱酯酶活性)。结果：在骨方面，补肾益精方既能量效依赖性地增加大鼠股骨各段骨密度，又能量效依赖性地提高大鼠股骨弯曲断裂载荷；在脑方面，补肾益精方不仅能上调大鼠脑组织M受体结合容量，而且又能抑制大鼠脑组织胆碱酯酶活性。结论：补肾益精方具有同时延缓雄性大鼠骨衰老与脑衰老的作用；推测该方似通过神经内分泌免疫的介导从整体角度调整衰老机体肾虚精亏之异常。
Experimental Study on Effect of Bushen Yijing Recipe in Delaying Senility of Bone and Brain of Aged Male Rats
Objective: To evaluate the effect of Bushen Yijing recipe (BSYJR) in delaying senility of bone and brain of aged male rats and infer its mechanism in delaying systemic senility.Methods: Forty male SD rats, 24 months old were randomly divided into 4 groups, the baseline control group, the aged control group (30 months old), the BSYJR high dose group and the BSYJR low dose group. The latter two groups received BSYJR treatment from 24 months old to 30 months old. Bone indexes (bone density of the proximal, middle and distal segments of left femur and break bending load of right femur) and brain& nbsp;indexes (binding capacity of M receptor and cholinesterase activity of brain) were measured after responding treatment.Results: In bone, BSYJR could not only increase the bone mineral density in various segments of femur, but also raise the bending break load of femur dose-effect dependently. In brain, BSYJR could both up-regulate the binding capacity of M receptor and inhibit the activity of cholinesterase.Conclusion: BSYJR could delay the senility of bone and brain in male rats, inferring that it might regulate integrally the abnormality of aging in Kidney Asthenia and Essence Deficiency through mediation of nerve-endocrine-immunity network. To evaluate the effect of Bushen Yijing recipe (BSYJR) in delaying senility of bone and brain of aged male rats and infer its mechanism in delaying systemic senility.Methods: Forty male SD rats, 24 months old were randomly divided into 4 groups, the baseline control group, the aged control group (30 months old), the BSYJR high dose group and the BSYJR low dose group. The latter two groups received BSYJR treatment from 24 months old to 30 months old. Bone indexes (bone& nbsp;density of the proximal, middle and distal segments of left femur and break bending load of right femur) and brain indexes (binding capacity of M receptor and cholinesterase activity of brain) were measured after responding treatment.Results: In bone, BSYJR could not only increase the bone mineral density in various segments of femur, but also raise the bending break load of femur dose-effect dependently. In brain, BSYJR could both up-regulate the binding capacity of M receptor and inhibit the activity of cholinesterase.Conclusion: BSYJR could delay the senility of bone and brain in male rats, inferring that it might regulate integrally the abnormality of aging in Kidney Asthenia and Essence Deficiency through mediation of nerve-endocrine-immunity network.
Key words Bushen Yijing Recipe, aged rats, bone density, bone load, integrated regulation, nerve-endocrine-immunity network, M receptor, cholinesterase
根据中医学的整体观念和“肾主骨生髓，脑为髓之海”的理论，80年代以来国内中西医结合学者分别应用不同的补肾益精类中药复方有效地延缓骨衰老(老年性骨质疏松症)、脑衰老(老年性痴呆)的研究报告已经屡见不鲜(1～7)，但是分别观察同一个补肾益精的中药复方延缓骨衰老、脑衰老的研究尚不多见；然而这种类型的研究却具有非常重要的意义；因为一方多效的研究结果可以提供基于整体观念的中医抗衰老理论最直接的药效学证据。因此，本项研究通过观察由何首乌、肉苁蓉等数种天然植物组成的具有补肾益精功效的中药复方——补肾益精方对雄性大鼠骨衰老与脑衰老的影响，旨在评价本方延缓老年大鼠骨衰老与脑衰老的作用以及探讨该方延缓机体衰老的机制，为中医药抗衰老提供整体防治的证据。
材料与方法
1 动物 24月龄SD雄性大鼠40只，(450±20)g，由上海中医药大学实验动物中心提供，上海市医学实验动物管理委员会实动合格证书号0017500；各组大鼠分笼饲养；自由摄取标准大鼠饲料(钙1.01%，磷0.78%)；自由饮用蒸馏水；室温(18±2)℃。
2 药物 补肾益精方(仙灵脾10g 何首乌15g肉苁蓉10g 骨碎补10g)由上海中医药大学基础医学院中医基础实验室提供。应用蒸馏水将补肾益精方胶囊制剂药粉配制成为悬浊液(浓度0.6g药粉/ml药液)，低剂量组按照10ml药液/kg体重的剂量给药(相当于成人用量的10倍)、高剂量组按照30ml药液/kg体重的剂量给药(相当于成人用量的30倍)。
3 仪器 SPA-Ⅳ型单光子骨密度仪(成都测试技术研究院)，放射源125I；INSTRON-1122型万能材料试验机(英国)；Wallac 1410液体闪烁计数器(Pharmacia)；Wellscan MK2酶标仪(Labsystems Dragon)。
4 动物分组与处理 40只24月龄SD雄性大鼠随机分为24月龄本底对照组、30月龄增龄对照组、补肾益精中药复方低剂量组、补肾益精中药复方高剂量组，每组各10只。24月龄本底对照组大鼠适应性正常喂养1周以后，全部处死；30月龄增龄对照组大鼠自24月龄正常喂养至30月龄时全部处死；低剂量组、高剂量组大鼠均自24月龄正常喂养的同时自由饮用补肾益精中药复方制剂悬浊液，至30月龄时全部处死。
5 观察指标及其检测方法
5.1 股骨近、中、远段骨密度及其测定 处死大鼠以后，取出左侧股骨，应用70%乙醇固定，剥离软组织；使用HB铅笔在剥离软组织的股骨的近、中、远段分别标记3条线(A线：股骨近段股骨小转子根部远侧；B线：股骨远段股骨髌面近侧；C线：A线与B线之中点)。沿标记的每一条线作骨横越扫描3次，3次获得的骨密度平均值，作为此线代表的股骨某段的骨密度。
5.2 股骨弯曲断裂载荷及其测定 处死大鼠以后，取出右侧股骨，应用70%乙醇固定，剥离软组织；置于万能材料试验机的支架上(跨距＝24mm)，以10mm/min的速度下压股骨中段，记录纸上呈现力线突然断裂的时候，记下此时股骨承受的弯曲载荷。
5.3 M受体结合容量及其测定 处死大鼠以后，断头取脑，分离脑组织，迅速加入制备缓冲液(50mmol/L KH2PO4-NaOH，10mmol/L MgCl2，0.25mol/L蔗糖，pH＝7.7)，用高速分散器匀浆。然后以3000r/min离心10min，取上清液，再以27000r/min离心15min，取沉淀，加反应缓冲液(50mmol/L KH2PO4-NaOH，10mmol/L MgCl2，0.2%维生素C，pH7.7)，用高速分散器制成悬浮液备用。同时采用微量Lowry法改进法测蛋白含量。以上操作均在0～4℃进行。按受体放射性配基结合分析法，测定M受体结合容量。
5.4 乙酰胆碱酯酶活性及其测定 处死大鼠以后，断头取脑，分离脑组织，称重后加1/15mol/L磷酸缓冲液，制成匀浆，然后以1500r/min离心15min，上清液即为酶样本。按羟胺比色法(8)，略加改进测定乙酰胆碱酯酶活性。
6 统计学处理 各组测定值以均数±标准差表示，两组均数之间比较采用t检验法。
结 果
1 补肾益精方对老年雄性大鼠股骨各段骨密度及其弯曲断裂载荷的影响 见表1。由表1可知，增龄对照组大鼠股骨各段骨密度明显低于本底对照组大鼠(P＜0.05)，增龄对照组大鼠股骨弯曲断裂载荷明显低于本底对照组大鼠(P＜0.05)；与增龄对照组比较，低剂量组近段、中段、远段骨密度分别增加了18%(P＞0.05)、16%(P＞0.05)、1%(P＞0.05)，高剂量组近段、中段、远段骨密度分别增加了30%(P＜0.05)、23%(P＜0.05)、12%(P＜0.05)，但是与本底对照组比较，高剂量组各段骨密度尚未达到本底对照组的水平(P＜0.05)；低剂量组股骨弯曲断裂载荷增加了24%，高剂量组股骨弯曲断裂载荷增加了33%，但是与本 底对照组比较，高剂量组股骨弯曲断裂载荷尚未达到本底对照组的水平(P＜0.05)。
表1 补肾益精方对老年雄性大鼠股骨各段骨密度及其弯曲断裂载荷的影响 (±s)
组 别 n 近段骨密度 中段骨密度 远段骨密度 弯曲断裂载荷
(N)
(g/cm2)
本底对照 10 0.27±0.01 0.31±0.03 0.23±0.02 143.00±14.17
增龄对照 10 0.19±0.03△ 0.22±0.03△ 0.18±0.02△ 102.00±12.39△
低剂量 10 0.22±0.03△ 0.25±0.04△ 0.19±0.01△ 127.00±27.50△
高剂量 10 0.25±0.01*△ 0.27±0.01*△ 0.20±0.01*△ 137.00±7.50*△
注：与增龄对照组比较，*P＜0.05；与本底对照组比较，△P＜0.05 2 补肾益精方对老年雄性大鼠脑组织M受体结合容量和乙酰胆碱酯酶活性的影响 见表2。增龄对照组大鼠脑组织M受体结合容量明显低于本底对照组大鼠(P＜0.05)，增龄对照组大鼠乙酰胆碱酯酶活性与本底对照组大鼠比较没有明显差异；与增龄对照组比较，低剂量组与高剂量组大鼠脑组织M受体结合容量明显上升(P＜0.05)，并且与本底对照组比较，低剂量组与高剂量组均达到本底对照组的水平；低剂量组与高剂量组大鼠乙酰胆碱酯酶活性明显受到抑制(P＜0.05)。
表2 补肾益精方对老年雄性大鼠脑组织M受体结合容量
和乙酰胆碱酯酶活性的影响 (±s)
组 别 n M受体结合容量
(fmol/mg蛋白)
乙酰胆碱脂酶活性
(μmol·h－1.g－1)
本底对照 10 782.89±143.62 211.90±57.91
增龄对照 10 575.23±81.64△ 206.89±64.51
低剂量 10 884.29±107.01*△ 170.13±90.23*△
高剂量 10 1109.19±267.83*△ 169.85±75.37*△
注：与增龄对照组比较，*P＜0.05；与本底对照组比较，△P＜0.05
讨 论
1 衰老病机(肾虚精亏)与抗衰老治则(补肾益精) 本项研究结果证实补肾益精方既能明显延缓骨衰老(提高骨密度与骨力学性能)，又能明显延缓脑衰老(提高脑M受体结合容量，抑制脑胆碱酯酶活性)。令人产生兴趣的是针对脑衰老与骨衰老却都使用以补肾益精作为治则的同一个中药复方，并且作用都非常明显。根据中医学理论，这种“异病同治”的现象不仅提示了不同的衰老疾病之间存在一个共同的病机，按照“以药探理”的思路可以认为脑衰老病机与骨衰老病机都可以归结成为肾虚精亏，而且也说明了“肾”、“精”、“髓”、“脑”、骨”之间的生理病理的有机联系。
2 神经-内分泌-免疫网络介导的整体调节机制 至于补肾益精方是通过何种整体途径发挥延缓机体不同组织(骨组织、脑组织等)衰老的效应，最近有学者应用受体放射性配基结合分析法、放射免疫分析法观察了补肾益精方对老年大鼠脑组织、脾组织的神经递质受体以及血清内分泌激素的影响，实验结果提示补肾 益精方可以通过神经-内分泌-免疫网络对机体的整体调节以及免疫应答对神经—内分泌轴的反馈调节，产生明显延缓脑组织衰老的作用(1)。如果考察骨组织与神经系统、内分泌系统、免疫系统的关系，那么可以发现骨代谢的调控与内分泌激素—钙磷调节激素以及性激素的参与密切相关(9～11)，并且内分泌系统又以神经内分泌轴的功能形式存在，同时骨组织中启动骨重建的始发细胞—破骨细胞亦起源于免疫细胞系统—单核巨噬细胞系统(12)，而且细胞因子在神经内分泌免疫网络中承担的信号传递分子的角色已经成为人们的共识(13，14)，其中包括具有骨吸收刺激作用的IL-1、TNF等以及具有骨吸收拮抗剂样作用的TGF-B等。由此推测补肾益精方延缓整个机体的衰老是否通过神经-内分泌-免疫网络的介导从多方位多层次地调节衰老机体肾虚精亏之异常，值得进一步研究。
1，莫启忠，宫 斌，方 军，等.补肾中药对SRBC免疫后老年大鼠脑组织中M和B受体功能的影响.免疫学杂志1997；13(2)∶90—93.
2，莫启忠，马 骏，宫 斌，等.补肾中药对拟痴呆小鼠胆碱能M受体及胆碱酯酶活性的影响.中国中西医结合杂志1996；16(2)∶99—101.
3，宫 斌，莫志红，莫启忠，等.补肾中药对SRBC免疫后老年大鼠脑和免疫组织中M和B受体功能的影响.中国免疫学杂志1993；9(6)∶377—380.
4，宫 斌，莫启忠，马 骏，等.补肾中药延缓老年小鼠脑功能衰老的机理研究.中国老年学杂志1996；16(3)∶170—172.
5，梁 力，江正玉，刘忠厚，等.补肾中药骨质疏松症临床观察.中医杂志1992；33(11)∶36.
6，赵伟康，章 连.固真方对老年大鼠脑内胆碱能神经系统的影响.上海中医学院上海市中医药研究院学报1990；4(1)∶19—21.
7，白坚石，何忠效，关志奎，等.抗衰老药物对大脑DNA甲基化酶的影响.中国中西医结合杂志1996；16(6)∶358.
8，李凤珍，孙曼霁.微量羟胺比色法测量胆碱酯酶活性.军事医学院院刊1986；10(3)∶211—214.
9，Beresford JN, Gallagger JA, Poser JW. Production of osteoc-alcin by human bone cells in vitro, effects of 1,25(OH)2D3, parathyroid hormone and glucocorticoids. Metab Bone Dis Relat Res1984；5∶229—234.
10，Azria M. The calcitonins physiology and pharmacology. Basel: Karger，1989∶7—21.
11，Prince RL, Smith M, Dike IM, et al. Prevention of postme-nopausal osteoporosis. A comparative study of exercise. Calcium supplementation and hormone-replacement therapy. N Engl J Med1991；325∶1189—1195.
12，Athansou NA. Physiology of Ostoclast. The Journal Bone & Joint Surgery1996；78(A)7∶1096.
13，Blalock JE. The syntax of immune-neuroendocrine commun-ication. Immune Today1994；15∶504.
14，金伯泉.细胞和分子免疫学.西安：世界图书出版社，1995∶367.