20种抗菌中药的凝集活性研究

                作者：张朝燕，蓝闽波， 戴亚娟

【摘要】  目的比较常见抗菌中药的凝集活性。方法选用盐-磷酸（PBS）、Tris-HCl、乙酸钠缓冲溶液提取20种常见抗菌中药的凝集素，测定各提取液对兔血红细胞的凝集作用。结果20种抗菌中药用不同pH的浸提液提取后表现不同的凝集活性，在3种不同pH的浸提取液中均具有较高凝集活性的有虎杖、山豆根、黄连、板蓝根。结论抗菌中药多数有较好的凝集活性，PBS对中药材中凝集素的提取具广谱性。

【关键词】  抗菌中药； 凝集素； 红细胞凝集试验

　　Abstract：ObjectiveTo compare the hemagglutination activities of the extractions from antimicrobial Chinese herbs.MethodsThe hemagglutination activities of the extractions from PBS,Tris-HCl,NaAcetate buffer solutions of 20 kinds of antimicrobial Chinese herbs on rabbit erythrocyte were measured by Hemagglutination titers.ResultsThe hemagglutination activities of these herbs were various in the three different buffer solutions;Furthermore, Rhizoma Polygoni Cuspidati, Radix Puerariae, Rhizoma Coptidis and Radix Isatidis  had high hemagglutination activities in the three different buffer solutions.ConclusionMost of antimicrobial Chinese have good hemagglutination activities;PBS can be used widely for the hemagglutination activities of the extractions from antimicrobial Chinese herbs.

　　Key words：Antimicrobial Chinese herbs;  Lectins;  Hemagglutination activity

    我国是水产养殖大国，但是水产病害一直是制约水产养殖发展的主要因素。为治疗和预防鱼虾贝类的疾病，人们广泛使用各种化学药物和抗生素。长期用药，不仅使病原菌的抗药性越来越明显，而且药物残留和环境污染日趋严重，生态养殖和科学防治成为水产养殖面临的迫切问题。在长期的养殖活动中，发现采用中药如黄连、大黄、板蓝根等可以防治一定的水产病害。这与中药能提高水产动物非特异性免疫能力，调整机体新陈代谢，提高抗应激能力等多种作用有关［1，2］。

    在水产动物中，分为无脊椎动物和脊椎动物。脊椎动物主要行使非特异性免疫与特异性免疫。属于无脊椎动物的甲壳动物和软体动物均缺乏免疫球蛋白，主要通过物理屏障、吞噬作用、溶菌作用和凝集作用等清除入侵的病原菌。凝集素(Lectin)能够与碳水化合物和糖蛋白结合, 从而使异源细胞或微生物发生凝集, 或使各种可溶性糖结合物发生沉淀, 被认为是机体自然防御机制中的免疫识别和监测分子。鱼虾贝类免疫系统不像高等动物那样完善, 凝集素等非特异性免疫因子在其防御病原微生物过程中发挥着重要的作用［3～6］。

    虽然目前关于中药提高免疫和抗菌用于水产病虫害防治的研究较多，但多数集中在粗提物、小分子和多糖等活性成分［7～11］，对于抗菌中药中的凝集素，如何通过外源途径提高水产动物的防病能力研究报道极少。鉴于此，本研究选用了3种浸提液提取20种中药的凝集素，测定这些常见抗菌药物的提取液对兔血红细胞凝集作用的强弱。旨在为研究水产养殖抗菌中药的抗菌和免疫物质基础提供研究思路和数据，为抗菌中药的筛选及水产病虫害的防治提供实验依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  中药材20种中药从上海董涵春堂药店购买，均未炮制处理，切细或粉碎，过筛，备用。

　　1.2  浸提缓冲液盐—磷酸缓冲液(PBS) pH7.2；0.05 mol/L Tris-HC1 1 mol/L NaC1缓冲溶液，pH8.0；0.05 mol/L NaAcetate(乙酸钠)(1 mol/L NaCl) 缓冲溶液，pH 5.0。

　　1.3  2％红血球生理盐水悬液兔红血球取自上海第二军医大学所提供的家兔，取兔新鲜血液，加入装有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇数分钟或用玻璃棒搅拌，除去纤维蛋白原，用生理盐水冲洗，离心2～3次(3 000r/min，5 min)，至上清液不呈红色为止。然后根据红血球体积用生理盐水配成2％的混悬液。

　　1.4  样品浸提液的制备将20种药材每份称重1 g，称取3份，分别加入10 ml的PBS缓冲液、Tris-HC1缓冲液、NaAcetate缓冲液浸泡过夜，然后将浸提液离心(10 000r/min，5 min) ，保存备用。

　　1.5  凝集效价测定［12］取96孔V型凝集板，每孔加入25 μl PBS，然后在每排第一孔加样品粗提液25 μl，依次倍比稀释，每一样品作3排，最后分别加入兔红血球悬液25 μl，设PBS为空白对照。静置1 h后，用肉眼和显微镜观察其凝集效价。
   
　　用同样方法分别做 Tris-HC1缓冲液、乙酸钠缓冲液样品的凝集效价。

　　2  结果

　　2.1  20种抗菌中药PBS提取液的凝集效价测定结果抗菌中药材中提取的凝集素生物活性的大小通常用凝集效价来表示，即能引起凝集现象凝集素的最高稀释倍数2n表示 (n为中药材待测样品所含凝集素的稀释倍数，稀释倍数越高其生物括性就越高)。各抗菌中药材的凝集素活性见表1。表1  20种抗菌中药PBS提取液的凝集效价（略）

    由表1可见，被测的20位味中药材分属l3科，其中17种有凝集活性，占到总数的85％。使兔红血球凝集的效价最高为256，最低为1。将抗菌中药材中提取的凝集素的凝集效价分列为四级(见表1)。一级效价大于128，计3种：虎杖、山豆根、板蓝根；二级效价为32～64，计6种：芦荟、鱼腥草、百合、党参、黄芪和黄连；三级效价为8～16，计7种：川芎、黄精、栀子、补骨脂、甘草、黄柏、北柴胡；四级效价小于8，计4种：大黄、黄芩、紫草、金银花。