凋亡调控基因BC12家族研究的新进展
摘要 凋亡的调控是细胞生理死亡和肿瘤发生的重要机制。对各种刺激诱导下细胞凋亡机制的分析有助于深入了解肿瘤细胞生物学及发现新的对策。凋亡调控基因BCL2家族成员可分为凋亡阻遏基因和凋亡促进基因。这些基因编码的蛋白质分子通过组成和/或影响同二聚体与异二聚体的不同比例而介导其对细胞存活的生物学效应。
关键词 凋亡，BCL2家族，机制，BCL2/BAX
抗凋亡基因BCL2家族的发现开辟了新一类癌基因——凋亡调控基因的新纪元[1]。不同于一般的癌基因与抑癌基因，凋亡基因的生物学效应是调控细胞存活期，而不影响细胞增殖，已知BCL2家族至少包括10个成员，成员之间通过组成同二聚体、异二聚体而促进或抑制凋亡，从而与肿瘤消长关系密切[2]。
1 BCL2
BCL2家族的主要代表，通过多种途径介导凋亡。
1.1 BCL2的作用需要一完整的膜结构
BCL2的羧基端为疏水性，含有一个由19个氨基酸伸展成的跨膜结构。亚细胞组分分析、免疫荧光及共聚焦显微研究显示BCL2是一个26ku的胞内膜蛋白，其分布依细胞类型而定，在造血细胞表达水平最高，常位于线粒体、光面内质网及核膜。BCL2的羧基末端作为信号锚（signal anchor）序列插入线粒体外膜，其胞浆多肽部分对蛋白酶敏感。缺乏信号锚序列的BCL2抗凋亡功能不完全，但仍可与BAX结合成异二聚体。BCL2功能的发挥依赖于其在亚细胞膜的定位，BCL2氨基末端的大部分暴露于胞浆，借此可与胞浆蛋白或其他同时锚定在线粒体的BCL2样分子相互作用。BCL2可阻遏因缺乏线粒体DNA而不能携带传递的细胞凋亡，从而提示BCL2的功能并不需要一个完整的电子传递/氧化磷酸化链[3]。
1.2 BCL2能抑制氧化剂诱导的调亡
内质网、线粒体外膜及核膜是活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生部位。而BCL2也正存在于这些部位，这促使人们探讨BCL2与ROS在细胞凋亡中的作用关系，进而观察到BCL2能抗H2O2、t-丁基或甲萘醌（menadione）对细胞凋亡的诱导。在低浓度时，这些氧化物主要是通过凋亡途径杀死细胞。此外，BCL2可拮抗某些降低胞内还原型谷胱甘肽含量的制剂诱发的凋亡[4]。上述结果提示ROS可能涉及能被BCL2阻遏的细胞凋亡途径。近来研究反映抗氧化剂损伤为BCL2抗凋亡的原理之一，但在此途径中BCL2是直接或间接作用仍未知。
1.3 BCL2 影响细胞内钙内流
观察BCL2功能的另一方面是其存在于内质网，而后者与胞内钙自稳的调节有关，Ca2+影响凋亡，因为某些核小体DNA的降解为钙依赖性，且Ca2+通道激活剂可诱导淋巴细胞凋亡，尽管胞内Ca2+总量的改变并不与凋亡的诱导一致，但可出现胞内Ca2+的重新分布，观察钙泵抑制对凋亡的影响，人们发现凋亡与Ca2+流从内质网进入胞质有关，且BCL2能阻断这种钙流[5]。胞内Ca2+贮存的流动性可能仅为复杂凋亡程序的环节之一，尚未明确BCL2是直接还是间接影响钙自稳。
大量资料显示BCL2可延长细胞存活期，抑制各种因素，包括物理、化学、生物因素等对细胞凋亡的诱导。BCL2的超常表达与肿瘤的发生有关。但是，BCL2并不能阻抑所有细胞的凋亡。鉴于BCL2能够阻抑由如此多不同信号及细胞内途径造成的调亡，据此推测BCL2在凋亡途径中作用必定在许多信号汇集后某个环节，因此，理论上细胞凋亡的下游途径可能不止一个，尽管BCL2阻遏凋亡的确切机制未明，业已了解其阻抑增殖期细胞的调亡，延长非增殖期细胞的存活时间[6]。
2 BAX
BAX是重要的异二聚体伴分子，促进细胞凋亡，BAX因与BCL2蛋白共同免疫沉淀而被鉴定，是21ku蛋白，含一类似于存在BCL2的疏水性羧基末端，与 BCL2共存在于线粒体。BAX在组织中广泛表达，包括在细胞正常成熟过程中发生死亡的许多部位。BAX与BCL2的同源区主要丛集在两个保守区BH1和BH2，但BAX中BH2的一个外显子接合点（exon juncture）是保守的。BAX与BCL2构成异二聚体，而BAX自身组成二聚体。BCL2蛋白中BH1和BH2的定点突变（sitedirected mutagenesis）提示该结构域对结合BAX的重要性。当BCL2与BAX的结合点断裂（disrupted），则BCL2对细胞的保护性消失，说明BCL2必须结合BAX才能发挥其作用，较能说明问题的实验是，当BH1的单个氨基酸如甘氨酸（Gly145）被丙氨酸（Ala）或谷氨酸（Glu）取代及BH2的色氨酸（Trp188）被Ala替换时，BCL2与BAX的结合点完全消失，这时BCL2死亡阻遏效应不复存在[7]。BCL2与BAX蛋白量的比率决定异二聚体（BCL2/BAX）与同二聚体（BAX/BAX）的比值，这对决定细胞凋亡的易感性起关键作用。一般而言，BCL2的过度表达与BAX形成异二聚体而阻抑凋亡。然而，BCL2与BAX的比值依细胞系的发育阶段而异，BCL2/BAX比值的高低是判断恶性肿瘤耐药、复发的有用指标[8]。
3 BCL-X
BCL-X类似于BCL2，但有不同的细胞系特异性， bCL-X是以BCL2为探针，采用低严紧型杂交所克隆的，与BCL2有44%的氨基酸同源。BCL-X基因有两种不同的剪接方式，BCL-XL编码233个氨基酸，并含高度保守的BH1和BH2结构域；而BCL-Xs缺乏含BH1和BH2结构域的63个氨基酸的伸展部分，BCL-XL含一个疏水性羧基末端的跨膜结构，且其作用及亚细胞分布类似于BCL2[9]。在哺乳动物细胞，BCL-XL能与BAX组成异二聚体，当前者的单一氨基酸被取代，则其结合BAX的性能消失，进而消除其对凋亡的阻抑效应[10]。表达 bCL-XL的转基因小鼠（缺乏BCL2）的T细胞存活期延长，提示BCL-XL可取代BCL2的遗传特性。BCL-Xs可分别于BCL2、 bCL-XL组成异二聚体[10]。
尽管BCL-XL与BCL2存在相似性，但两者的性能不完全相同，有些细胞的凋亡可被BCL-XL抑制，但不受BCL2阻遏。外周T淋巴细胞的激活导致BCL-XL的快速产生，但非BCL2。在成人大脑细胞中，BCL-XL的表达显著高于BCL2。其他试验也提示BCL2与BCL-XL的表达方式有别[11]。因此，在不同类型细胞中，BCL-XL和BCL2的特异性作用也许不同，在儿童急性淋巴细胞白血病中，观察到BCL-XL与BCL2的表达与调节作用均有所差别[12]。
4 MCL-1和A1
MCL-1和A1与BCL2同源，均为抗凋亡基因，MCL-1基因是髓性白血病细胞经佛波醇酯诱导后所克隆，其与BCL2的同源区主要位于羧基端，含BH1及BH2结构域。但MCL-1的氨基末端异于BCL2，因前者含2个PEST序列[13]。A1基因是造血细胞在粒-巨噬细胞集落刺激因子和脂多糖诱导下产生的早期反应基因[14]。在酵母双杂交系统中，MCL-1和A1分别与BAX强烈结合[10]，提示存在MCL-1/BAX和A1/BAX异二聚体的可能性。早期资料未发现动物细胞中MCL-1与BAX的免疫共沉淀，但新近报道在造血细胞中MCL-1与BAX相互作用而抑制细胞凋亡[15]。
5 BAK
BAK基因是新发现的细胞凋亡促进因子。BAK（BCL2 homologous antagonist/killer）是通过与E1B-19K 蛋白相互作用或聚合酶链反应产物克隆（PCR克隆）所发现[16]。作为BCL2家族成员之一，BAK含BH1和BH2结构域，其功能类似于BAX；拮抗BCL2、BCL-XL及E1B-19K的抗凋亡效应[17]，但有一个实验例外，在经EB病毒转染的原始淋巴样细胞系WL-L2中，当撤除血清并用甲萘醌处理后，BAK延长该细胞系的存活期[17]。这显示BAK蛋白的作用与其他凋亡蛋白的前后依赖性，与同BCL2组成二聚体相比，BAK与BCL-XL构成异二聚体的能力更强[16]。
6 BCL2同 源区存在于DNA病毒蛋白
在与DNA病毒蛋白的同源性方面，BCL2家族基因的保守作用是显著的。除腺病毒E1B-19K基因外，EB病毒的BHRF1基因在一些潜伏性感染和细胞裂解的早期表达，其BH1和BH2结构域与BCL2有同源性，非洲猪热病毒编码的一个同源基因LMW5-HL在单核吞噬细胞受感染的早期表达[18]。这些病毒同源物的作用也许是维持宿主细胞处于感染状态的功能。
7 BAD
BAD是BCL2/BAX、BCL-XL/BAX异二聚体的负调节基因。BAD是BCL2/BCL-XL相关死亡促进因子，作为BCL2、 bCL-XL异二聚体伴分子而促进细胞凋亡[19]。但在调亡途径中，其作用异于其他具有BH1和BH2结构域的BCL2家族成员。BAD缺乏典型的羧基端跨膜结构，提示其并非一完整膜蛋白。与同BCL2作用相比，BAD与BCL-XL的结合更强，BAD以浓度依赖性方式替换BCL-XL/BAX、BCL2/BAX异二聚体中的BAX，使BAX游离而促进细胞凋亡。当一细胞系的所有细胞内异二聚体（BCL-XL/BAX和BCL2/BAX）的含量≥50%时，则细胞耐受凋亡；而当细胞内BAX同二聚体＞80%时且在适当信号诱导下则细胞出现凋亡[19]。这表明BAD通过调节BAX同二聚体与异二聚体量的比值而介导凋亡，客观上，尚未明确调控细胞死亡的胞内环境激活因素是BAX同聚体还是异二聚体（BCL-XL/BAX和BCL2/BAX）。也许上述两种二聚体均被激活，其比值才是启动凋亡的关键环节，这些提示细胞凋亡的影响因子BCL2和BCL-XL本身受蛋白质-蛋白质相互作用所调节。
8 BAG-1
另一个正调节（positively modulate）BCL2抗凋亡的蛋白是BAG-1[20]。体外实验显示BAG-1与BCL2存在相互作用。但是，BAG-1并非BCL2家族成员在同源物，其所含的一个泛醌样结构提示其作用机制也许是与影响蛋白质的稳定性有关。有趣的是，BAG-1和BCL2的共表达保护Jurkat t细胞免受抗Fas抗体和细胞毒T细胞的杀伤，说明如果有适当的调节蛋白存在时，BCL2可阻遏非BCL2依赖性的凋亡信号。
9 CED-9
CED-9是与BCL2同源的抗凋亡基因。CED-9是对秀丽线虫（C.elegance）的体细胞作遗传学研究鉴定的凋亡调节基因。CED-9与BCL2在结构和功能上有显著的同源性，两者的氨基酸序列有24%相同和49%相似，均含疏水性结构、羧基未端信号锚（signal anchor）序列及高度保守的BH1和BH2结构域，但CED-9的BH2中存在保守的外显子接合点（conserved exon junction）。功能上，BCL2转基因能阻抑秀丽线虫的一些细胞死亡，并通过部分替换CED-9而抗CED突变体的生态性死亡[21，22]。有趣的是，Gly145 glu突变体，于BCL2是功能丧失；而性突变于CED-9则是功能获得（gain-of-function）性突变。此结果肯定了BH1结构域的重要性，同时提示进化上存在差异。CED-9和BCL2两者序列和功能的保守性说明细胞死亡的遗传途径普遍存在于多细胞有机体。
10 结语
如上所述，BCL2家族包括凋亡阻遏基因和凋亡促进基因，分子间通过组成不同质、量的二聚体而调控细胞凋亡。各种伴分子间结合具有选择性，其结合力量存在严格的等级差异。而且，BCL2家族成员又与其他凋亡调控分子相互关联，构成一异常复杂的调控，有机地影响凋亡信号传导。
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