新化合物SIPI5052对离体血管收缩功能的影响
【关键词】 哌嗪类；主动脉；肠系膜动脉；收缩反应；钙通道；抗脑缺血
Effect of SIPI5052，a new chemical entity，on the contraction of isolated arteries
【Abstract】 Objective To study the effect of a new anti-stroke chemical entity SIPI5052 on Ca2+ channels，by observing its effect on norepinephrine or KCl induced contraction in isolated blood vessels.Methods Using IOX computerized system (EMKA Technologies，Paris，France) to record the changes of isometric tension in isolated rat aorta，rabbit aorta and rabbit mesenteric artery.Results SIPI5052 can significantly inhibit norepinephrine or KCl induced contraction in the examined blood vessels and the effect is concentration-dependent.The minimum inhibitory concentration in rat aorta is 3×10-6mol/L，with the IC50value of 1.66×10-4mol/L.The minimum inhibitory concentration in rabbit aorta and mesenteric artery is 3×10-4mol/L，and the IC50value is between 4.17×10-4 and 5.37×10-4mol/L.Conclusion SIPI5052 can block Ca2+ channels.Rat isolated blood vessels are more sensitive to SIPI5052 than rabbit isolated blood vessels.Ca2+ channel blocking may be involved in the anti-stroke action of SIPI5052.
【Key words】 piperazidines; aorta; mesenteric artery; contraction; calcium channel; anti-cerebral ischemia
SIPI5052属芳烷甲酰基哌嗪类结构，化学名为N1-苯甲酰甲基-N4-苄胺甲酰甲基哌嗪二盐酸盐。本品是上海医药研究院定向设计、合成、筛选出的兼有抗局灶性脑梗死作用和对受损脑神经元有保护功能的全新化合物［1］。SIPI5052已获得发明专利授权，专利号为：ZL 02111614.8，亦已申请美国和欧洲专利，申请号分别为10/513，699和03720098.7。SIPI5052作为抗脑中风急救用药正在进行一期临床试验，国家食品药品监督管理局的批件号为2006L01411，被批准的药品名为盐酸非那嗪奈。SIPI5052可能成为新一代NMDA受体多胺调节位点拮抗剂，但目前其脑神经保护作用机理不甚明确。初步的机制研究显示其抗脑缺血的作用与拮抗ADP诱导的血小板聚集无关，并且SIPI5052抗NMDA受体的作用机制与传统的NMDA受体NR1/ NR2A亚单位拮抗剂不同，可能与阻断兴奋性氨基酸的作用通路有关。本研究目的在大鼠胸主动脉、家兔胸主动脉和肠系膜动脉上，观察一类新药SIPI5052对去甲肾上腺素或高钾诱导的血管收缩反应的影响，以明确SIPI5052是否具有钙通道阻断作用，进一步阐明其抗脑缺血的机制。
1 材料与方法
1.1 药品 SIPI5052，上海医药工业研究院提供，批号040107，含量99.65%；重酒石酸去甲肾上腺素，2mg/ml，上海禾丰制药有限公司生产，批号030701。氯化乙酰胆碱，美国SIGMA公司生产，批号033K260。Krebs-Henseleit 生理溶液（K-H液）的组成为(mmol/L)：NaCl 118.4，KCl 4.7，CaCl2 2.5，MgSO4 1.2，KH2PO4 1.2，NaHCO3 25.0，Glucose 11.1，CaNa2-EDTA 0.026。
1.2 仪器 法国EMKA公司制造的计算机化离体血管功能测定系统［2］。
1.3 实验动物 雄性Sprague-Dawley大鼠，体重350~450g，由上海SIPPR/BK实验动物中心提供。雄性家兔，体重2~2.5kg，由第二军医大学实验动物中心提供。
1.4 方法 大鼠采用戊巴比妥60mg/kg腹腔注射麻醉，开胸，取胸主动脉。家兔采用戊巴比妥耳缘静脉注射麻醉，先开腹取肠系膜动脉，再开胸取胸主动脉。将取出的血管立即移入95%O2+5%CO2饱和的K-H生理溶液内，仔细剔除粘附于动脉周围的脂肪结缔组织，截取3mm左右（大鼠胸主动脉和家兔肠系膜动脉）或5mm左右（家兔胸主动脉）的动脉环。随后用金属钩将动脉环悬置于含K-H液，95%O2+5%CO2，37℃浴槽中，一端连接张力换能器及整个计算机化记录系统，另一端固定。通过观察动脉环等长张力改变以衡量血管的收缩和舒张反应［2，3］。调节静息张力为2g（大鼠胸主动脉）或2.5g（家兔肠系膜动脉）或5g（家兔胸主动脉）［3，4］，稳定60min。采用去甲肾上腺素(10-7mol/L)或高钾(家兔主动脉，20mmol/L; 家兔肠系膜动脉，30mmol/L)引起血管收缩反应，用乙酰胆碱10-5mol/L引起血管舒张反应检验内皮存在与否，清洗后再稳定20min进行分组实验。分别给予不同浓度的试药SIPI5052（10-7～3×10-3mol/L），孵育10min后，再观察去甲肾上腺素或高钾引起的收缩反应，计算给药后收缩反应的抑制百分率，制作量-效曲线，并采用绘图法计算IC50［5］。
1.5 数据处理及统计学方法 SIPI5052对去甲肾上腺素或高钾诱导的血管收缩的抑制作用以去甲肾上腺素(10-7mol/L)或高钾(家兔主动脉，20mmol/L; 家兔肠系膜动脉，30mmol/L)引起血管收缩反应的最大张力为基准(100％)，用张力减少的百分比表示，绘图法计算IC50。实验结果用均数±标准误表示。
2 结果
实验显示，在所有动脉环上均观察到乙酰胆碱引起的血管舒张反应，表明血管内皮存在。SIPI5052对大鼠和家兔的主动脉血管及肠系膜血管的收缩反应均有抑制作用，呈剂量依赖性。在大鼠主动脉上，SIPI5052 10-6mol/L时对去甲肾上腺素诱导的血管收缩的平均抑制率为1.48%，3×10-6mol/L时观察到明显的抑制作用，且随浓度增加其抑制作用增强，IC50= 1.66×10-4mol/L，100%抑制浓度为3×10-3mol/L(图1)。在家兔主动脉和肠系膜动脉上，SIPI5052 10-4mol/L时对高钾或去甲肾上腺素诱导的血管收缩反应几乎没有抑制作用，3×10-4mol/L时显示明显的抑制作用，并随药物浓度增加其抑制作用增强，100%抑制浓度≥3×10-3mol/L（见图2，见图3）。SIPI5052抑制高钾诱导的家兔肠系膜动脉收缩的IC50= 4.17×10-4mol/L，抑制高钾诱导的家兔主动脉收缩的IC50= 5.37×10-4mol/L (图2)。SIPI5052抑制去甲肾上腺素诱导的家兔肠系膜动脉收缩的IC50= 4.68×10-4mol/L，抑制去甲肾上腺素诱导的家兔主动脉收缩的IC50= 5.01×10-4mol/L (图3)。由此可见，SIPI5052抑制大鼠血管收缩的起效浓度和IC50较家兔血管低，最大抑制浓度相接近。
图1 SIPI5052对去甲肾上腺素（NE）诱导 的大鼠胸主动脉收缩反应的抑制作用
图2 SIPI5052对高钾诱导的家兔肠系膜动脉和主动脉收缩反应的抑制作用
图3 SIPI5052对去甲肾上腺素（NE）诱导的家兔肠系膜动脉和主动脉收缩反应的抑制作用
3 讨论
去甲肾上腺素和高钾是经典的血管平滑肌收缩剂。去甲肾上腺素和高钾分别通过开放受体操纵的Ca2+通道和电压依赖性Ca2+通道使细胞内Ca2+增加［6］，同时高钾还可以导致钙增敏［7］，从而引起平滑肌收缩。本实验在大鼠和家兔的离体血管上，观察到SIPI5052可明显抑制去甲肾上腺素或高钾诱导的收缩反应，并且随着药物浓度的升高可以达到完全抑制，说明SIPI5052可通过抑制受体依赖性Ca2+通道和电压依赖性Ca2+通道使平滑肌张力降低，具有钙拮抗作用。
从实验现象可知，SIPI5052对去甲肾上腺素或高钾诱导的血管收缩反应的抑制呈剂量依赖性。在大鼠血管上，起效浓度为3×10-6mol/L，IC50为1.66×10-4mol/L，100%抑制浓度为3×10-3mol/L。在家兔血管上，起效浓度为3×10-4mol/L，IC50为4.17×10-4~5.37×10-4mol/L，100%抑制浓度≥3×10-3mol/L。由此可见，SIPI5052抑制大鼠血管收缩的起效浓度和IC50较家兔血低，而最大抑制浓度相接近。这一结果提示大鼠血管对SIPI5052的反应较家兔血管敏感。
目前，该化合物已作为抗脑中风急救用药进行一期临床试验。动物实验已证明SIPI5052静脉注射可剂量依赖性地明显对抗动物实验性脑梗死，对缺血引起的组织学和神经学损害有明显的预防和作用。SIPI5052的初步机制研究显示其抗脑缺血的作用与拮抗ADP诱导的血小板聚集无关，并且对抗NMDA的作用机制与传统的NMDA受体NR1/ NR2A亚单位拮抗剂不同，可能与阻断兴奋性氨基酸的作用通路有关。本实验观察到SIPI5052有钙通道阻断作用，这一作用很可能是SIPI5052抗脑缺血的作用机制之一。大量临床试验证实钙拮抗剂对于脑缺血的预防和促急性脑缺血后的功能恢复有很好的疗效。尼莫地平就是常用的治疗急性脑缺血的钙拮抗剂。经典理论认为细胞内钙超载是脑缺血后病理生理变化的主要发生机制之一［8］。钙拮抗剂作用于钙通道，阻滞细胞膜Ca2+内流，减轻或防止细胞内钙超载引起的一系列病理改变，同时扩张脑血管，解除脑血管痉挛，改善缺血区的血流和O2供应外，最终减轻缺血性损伤，减轻脑水肿，缩小脑梗死范围。我们还通过换算比较了离体血管上观察到的SIPI5052最低起效浓度与整体动物上抗脑缺血的最低有效剂量，发现离体实验的最低起效浓度落在整体实验中与最低有效剂量相应的血药浓度范围之内。由此我们推测钙拮抗作用是SIPI5052抗脑缺血的作用机制之一。
【】
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