中药地椒乙醇提取物对人白血病细胞增殖的抑制作用
作者：孙震晓，张英慧，程霜，马清温，郭善利，张金保
【关键词】 乙醇提取物
［摘要］目的：筛选中药地椒乙醇提取物的抗肿瘤活性成分，探讨其可能的抗肿瘤作用机制。方法：从野生地椒乙醇提取物中分离得到乙酸乙酯、正丁醇和丙酮3种萃取组分，以体外培养的人白血病细胞株K562和HL60作为研究对象。将各萃取组分与肿瘤细胞作用一定时间后，计数存活肿瘤细胞数，分析药物对肿瘤细胞生长曲线的影响，考察各组分对肿瘤细胞生长的抑制作用。以去甲斑蝥素作为阳性对照组，通过形态学分析等方法，研究中药地椒乙醇提取物可能的抗肿瘤作用机制。结果：中药地椒乙酸乙酯萃取物对人白血病细胞株K562和HL60均有显著的抑制作用，且呈药物浓度依赖性，并可诱导肿瘤细胞凋亡；而正丁醇和丙酮萃取物对两种白血病细胞均无显著的抑制作用。结论：体外实验表明，乙酸乙酯萃取物是中药地椒乙醇提取物中主要的抗肿瘤活性成分。
［关键词］地椒; 乙醇提取物; 乙酸乙酯萃取物; 抗肿瘤药; K562; HL60
Antitumor effect of ethanol extracts from Thymus quinquecostatus Celak on human leukemia cell line
ABSTRACT Objective: To screen the antitumor fraction of ethanol extracts from Thymus quinquecostatus Celak and investigate its antitumor effect on human leukemia cell line. Methods: Ethyl acetate, nbutanol and acetone fractions were separated from the ethanol extracts of wild Thymus quinquecostatus Celak. Growth inhibiting effects of these extracts on human leukemia cell lines K562 and HL60 were determined by live cell counting and cell growth curve analysis. The possible antitumor mechanism was studied by morphological analysis with norcantharidin as a positive control. Results: Ethyl acetate fraction could significantly inhibit the proliferations of K562 and HL60 cells, and the inhibiting effect depended on the concentration of ethyl acetate fraction. Ethyl acetate fraction could induce apoptosis of K562 and HL60 cells. The nbutanol and acetone fractions had no significant inhibiting effect on K562 and HL60 cells. Conclusion: Ethyl acetate fraction is the major antitumor fraction in ethanol extracts from Thymus quinquecostatus Celak.
KEY WORDS Thymus quinquecostatus Celak; ethanol extract; ethyl acetate fraction; antineoplastic agents; K562; HL60
中药地椒（Thymus quinquecostatus Celak），又名百里香，为唇形科百里香属植物，属矮小半灌木，茎匍匐生长，常生长于山坡和海边低丘上［1,2］。药用其地上部分，阴干或鲜用，味辛、性温，有小毒，有祛风解表、行气止痛之功［3］。民间单用地椒或配伍其他中药癌症，确有一定的疗效。我们在对地椒进行有效成分提取、分离及分析的基础上［4,5］，以小鼠移植性肿瘤为模型，研究了地椒的抗肿瘤作用及其对机体免疫功能的影响［6］。随后，我们又以体外培养的人红白血病K562细胞和人早幼粒白血病HL60细胞为研究对象，进一步筛选地椒乙醇提取物中的抗肿瘤活性成分，并阐明其可能的抗肿瘤作用机制，现报道如下。
1材料与方法
1.1实验材料 （1）野生地椒采自山东省平邑县山区，全草阴干后粉碎，过40目筛。经乙醚浸泡24 h后，35℃回流3 h抽滤，去滤液，滤渣用75%酒精溶液冷浸24 h，72 ℃回流3 h，抽滤得乙醇提取物溶液。乙醇提取物进一步用乙酸乙酯、正丁醇、丙酮逐级萃取，获得地椒乙酸乙酯、正丁醇和丙酮萃取物3个组分，冷冻真空干燥后，用二甲亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）配制成不同浓度的饱和药物溶液，分别为：乙酸乙酯萃取物10 mg/ml、正丁醇萃取物20 mg/ml和丙酮萃取物2 mg/ml，置4 ℃保存。使用时用细胞培养液稀释100倍以上，使DMSO终浓度≤1%。（2）去甲斑蝥素（norcantharidin, NCTD）由北京第四制药厂王广生教授惠赠，用RPMI1640培养液加热溶解，－20℃保存［7］。（3）小牛血清为Hyclone公司产品。（4）青霉素、链霉素、庆大霉素、台盼蓝和Giemsa染液等为国产分析纯试剂。
1.2体外培养人肿瘤细胞系及培养条件 将人红白血病K562细胞和人早幼粒白血病HL60细胞（聊城大学细胞分子生物学重点实验室冻存）接种于含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，在37 ℃含5% CO2的培养箱内培养传代。所有实验均在细胞的对数生长期内进行。实验所用培养液均加入庆大霉素50 μg/ml［8］。
1.3台盼蓝染色活细胞计数法测定地椒乙醇提取物3种萃取组分对体外培养的人白血病细胞生长的抑制作用 取处于对数生长期的K562细胞和HL60细胞悬液分别接种在24孔细胞培养板（Costar公司产品）上，每孔加入2 ml细胞悬液，每种细胞接种12个孔，分为6组，每组平行2个孔。第1、6组为空白对照组；第2组加入20 μl DMSO，使其终浓度为1%；第3、4、5组分别加入20 μl的丙酮萃取物、正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物药物溶液，使其终浓度分别为20、200和100 μg/ml。将24孔细胞培养板置于37 ℃含5% CO2的培养箱内培养，48 h后取样，各孔均取90 μl，加10 μl 4%台盼蓝染液，反应5 min后，用血球计数板计数拒染细胞数作为活细胞数，15 min内完成计数［9］。每组有平行2个孔，取两孔的平均值。实验重复3次。
1.4测定地椒乙酸乙酯萃取物对肿瘤细胞生长的抑制作用 地椒乙酸乙酯萃取物冷冻干燥后，用DMSO溶解，配制成3种浓度，分别为10、1和0.1 mg/ml。取处于对数生长期的K562细胞，用含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和50 μg/ml庆大霉素的RPMI1640培养液配制成浓度为5×104/ml的细胞悬液。将细胞接种在24孔细胞培养板上，每孔加2 ml细胞悬液。24孔细胞培养板置于培养箱内培养24 h，然后将24个孔分为6组，每组平行4个孔，其中3个孔用来取样计数，另1个孔用来取样做Giemsa染色。第1组为空白对照组；第2组加入20 μl DMSO，即1% DMSO对照组；第3、4、5组分别加入20 μl各种不同浓度的地椒乙酸乙酯萃取物，使其终浓度分别为1、10和100 μg/ml；第6组加入20 μl NCTD，使其终浓度为10 μg/ml，作为阳性对照组。加药即刻及加药后12、24、36、48、60、72 h，分别取样90 μl，加10 μl 4%的台盼蓝染液，计数台盼蓝拒染细胞数，每组平行3个孔，取3个孔的平均值。实验重复3次。按活细胞密度取样时相得出对照组和各加药组K562细胞的生长曲线图。按加药24 h时细胞生长抑制率药物浓度得出细胞生长抑制率曲线。细胞生长抑制率方法：（1）各种浓度的地椒乙酸乙酯萃取物药物溶液对细胞生长的抑制率＝（1% DMSO对照组活细胞数－乙酸乙酯萃取物实验组活细胞数）/1% DMSO对照组活细胞数；（2）10 μg/ml NCTD对细胞生长的抑制率＝（空白对照组活细胞数－NCTD阳性对照组活细胞数）/空白对照组活细胞数。
取处于对数生长期的HL60细胞配制成浓度为2×105/ml的细胞悬液，实验方法同K562细胞，在加药即刻及加药后24和48 h分别取样计数，实验结果的处理同K562细胞。
1.5细胞形态学观察
1.5.1活细胞的形态学 采用日本Olympus IX70121型倒置显微镜（带保温装置），在动态条件下观察活细胞形态学。
1.5.2Giemsa染色观察细胞及细胞核形态 取K562细胞或HL60细胞与地椒萃取物及NCTD孵育不同时间的细胞悬液100 μl，1 000 r/min离心3 min，涂片，细胞固定后，Giemsa染色20～30 min，用Olympus BX50系统显微镜观察并摄影。
1.6统计学方法 所有实验数据均采用SPSS 10.0软件，计量资料均数用x±s表示，组间均数比较采用t检验。
2结果
2.1中药地椒乙醇提取物3种萃取组分对人白血病细胞生长的抑制作用 丙酮萃取物、正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物对K562细胞和HL60细胞作用48 h后取样，各组活细胞数，结果显示：地椒乙酸乙酯萃取物与空白对照组及1% DMSO对照组比较，K562和HL60活细胞数均显著下降（P＜0.01），说明地椒乙酸乙酯萃取物有显著的抗肿瘤作用；而地椒丙酮萃取物和正丁醇萃取物则没有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用。见表1。
表1 中药地椒丙酮萃取物、正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物对人白血病细胞生长的抑制作用（略）
Tab 1 Growth inhibiting effects of acetone, nbutanol and ethyl acetate fractions from Thymus quinquecostatus Celak on human leukemia cells
*P＜0.01, vs 1% DMSO control group
2.2地椒乙酸乙酯萃取物对人白血病细胞生长的抑制作用 以取样时相为横坐标、活细胞密度为纵坐标作图，得到细胞的生长曲线。不同浓度的地椒乙酸乙酯萃取物对K562和HL60白血病细胞的生长均有不同程度的抑制作用，尤以浓度为100 μg/ml的地椒乙酸乙酯萃取物对肿瘤细胞的杀伤抑制作用最为明显，与10 μg/ml NCTD的作用相当或更强。见图1、图2。
浓度为1、10和100 μg/ml的地椒乙酸乙酯萃取物作用于K562细胞24 h，其生长抑制率分别为24.0%、41.1%和79.6%；作用于HL60细胞24 h，其生长抑制率则分别为1.1%、24.5%和65.6%。由此说明：虽然两种白血病细胞对低浓度地椒乙酸乙酯萃取物的敏感程度并不相同，但高浓度的地椒乙酸乙酯萃取物对两种白血病细胞的生长均有很强的抑制作用，且随着药物浓度的增加其抑制作用也相应增强。见图3。
2.3NCTD及地椒乙酸乙酯萃取物诱导K562和HL60细胞凋亡 NCTD作用于K562细胞24 h后诱导细胞发生凋亡的形态学变化见图4。100 μg/ml地椒乙酸乙酯萃取物作用于K562细胞12 h后就出现细胞凋亡现象，形成凋亡小体，24 h后出现大量的细胞凋亡，见图5。100 μg/ml地椒乙酸乙酯萃取物作用于HL60细胞24 h后亦有明显的细胞凋亡现象，见图6。
图1 K562细胞生长曲线（略）
Fig 1 Growth curve of K562 cells
图2 HL60细胞生长曲线（略）
Fig 2 Growth curve of HL60 cells
图3 不同浓度地椒乙酸乙酯萃取物对K562和HL60细胞生长的抑制作用（略）
Fig 3 Growth inhibiting effect of different concentrations of ethyl acetate fraction from Thymus quinquecostatus Celak on K562 and HL60 cells
图4 10 μg/ml NCTD作用于K562细胞24 h诱导细胞凋亡（Giemsa染色, ×350）（略）
Fig 4 Apoptosis of K562 cells induced by 10 μg/ml NCTD for 24 h (Giemsa staining, ×350)
图5 100 μg/ml地椒乙酸乙酯萃取物作用于K562细胞24 h诱导细胞凋亡（Giemsa染色, ×350）（略）
Fig 5 Apoptosis of K562 cells induced by 100 μg/ml ethyl acetate fraction from Thymus quinquecostatus Celak for 24 h
(Giemsa staining, ×350)
图6 100 μg/ml地椒乙酸乙酯萃取物作用于HL60细胞24 h诱导细胞凋亡（Giemsa染色, ×350）（略）
Fig 6 Apoptosis of HL60 cells induced by 100 μg/ml ethyl acetate fraction from Thymus quinquecostatus Celak for 24 h
(Giemsa staining, ×350)
3讨论
我们曾利用小鼠移植性肿瘤模型首次报道了地椒提取物的抗肿瘤作用及其对小鼠免疫系统的影响［6］。本实验在此基础上对地椒乙醇提取物作进一步的成分分离和药理研究，发现其中的乙酸乙酯萃取物有较好的杀伤肿瘤细胞的作用，对人红白血病K562细胞和人早幼粒白血病HL60细胞生长的抑制作用随作用时间的延长和药物浓度的增加而增强。而地椒丙酮萃取物及正丁醇萃取物则没有明显的抑制杀伤白血病细胞的作用。
10 μg/ml NCTD作用于K562细胞24 h，可明显诱导K562细胞的凋亡，Giemsa染色可见凋亡细胞，主要表现为细胞核固缩、碎裂等［10,11］。本实验中我们发现：地椒乙酸乙酯萃取物同样可以诱导肿瘤细胞发生细胞核固缩、碎裂等形态学变化，推测其抑杀肿瘤细胞也主要是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡。与NCTD诱导K562细胞凋亡不同的是，地椒乙酸乙酯萃取物诱导两种白血病细胞发生凋亡并不伴随细胞有丝分裂期的阻滞［7］，推测其诱导肿瘤细胞凋亡应与NCTD诱导肿瘤细胞凋亡发生在不同的细胞周期。
我们以荷S180实体瘤小鼠为模型，用不同浓度的地椒乙酸乙酯萃取物溶液进行灌胃，初步的实验结果表明：地椒乙酸乙酯萃取物能明显抑制S180实体瘤的生长。此外，在对地椒乙醇提取物进行抗肿瘤活性成分筛选的基础上，我们对地椒乙酸乙酯萃取物组成成分进行了质谱扫描，结果表明：地椒乙酸乙酯萃取物中含有几十种黄酮成分。体外实验发现地椒黄酮具有很强的抗氧化活性［5］。地椒乙酸乙酯萃取物中的黄酮成分是否为地椒中主要的抗肿瘤活性成分还有待作进一步的药理研究及有效成分的分离分析工作。
［］
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