利用RT-PCR检测SM22基因在胃癌及正常组织中的表达差异

                          作者：吕中全，闫晓红，李文梅，吕有勇

【关键词】  RT-PCR检测

    【摘要】  目的  检测SM22（smooth muscle 22）mRNA在人胃癌及正常胃组织中的表达水平，探讨SM22基因与胃癌发生的关系，为进一步鉴定胃癌诊断筛查的标志物提供理论依据。方法  应用半定量RT-PCR检测42例胃癌组织及14例胃正常组织中SM22 mRNA的表达水平，并比较其差异。结果  在胃癌组织中SM22 mRNA的阳性表达率为92.86%（39/42），在正常组织中的阳性表达率为71.43%（10/14），差异无统计学意义（P＞0.05）。半定量光密度计数后SM22 mRNA表达量在胃癌组织和正常组织中分别为0.86±0.14和0.32±0.22，差异有统计学意义（P＜0.01）。在14对胃癌与正常配对标本中，有10对胃癌及正常组织中SM22 mRNA均表达阳性而且在肿瘤组织中表达量明显高于正常组织，有4对标本中SM22 mRNA只在胃癌组织中表达而在正常组织中表达阴性。结论  SM22 mRNA在胃癌组织中的表达量高于正常组织，提示其在胃癌发生中可能起到一定作用。

    【关键词】  SM22；胃癌；RT-PCR

    Expression differential and biological significance of SM22 mRNA in gastric cancer and normal tissues

        【Abstract】  Objective  To investigate the relationship between the expression level of SM22 （Smooth muscle 22） mRNA and tumorigenesis of human gastric cancer （HGC）.Methods  Semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction （RT-PCR） was performed to detect the expression level of SM22 mRNA in 42 gastric cancer tissues and 14 normal ones.Results  There were 92.86%（39/42） and 71.43% （10/14） positive expression of SM22mRNA in gastric cancer tissues and normal ones.There was no significant difference of the expression positive ratio between gastric cancer tissues and normal ones （P＞0.05）.The expression level of SM22 mRNA was 0.86±0.14 and 0.32±0.22 respectively,after being processed with semi-quantitative.There was significant difference of the expression positive ratio between gastric cancer tissues and normal tissues（P＜0.05）.Of 14 pairs of gastric cancer （GC）,10 pairs both primary gastric cancer and adjacent normal tissue could express SM22 mRNA,but the expression of SM22 mRNA was significantly higher than the expression in normal tissues,4 pairs SM22 mRNA were only expressed in gastric cancer tissue and was negative in matched normal tissues.Conclusion  The expression of SM22 mRNA was significantly higher in gastric cancer than in controlled normal tissue,which suggests SM22 play an role in carcinogenesis and development of gastric cancer.

    【Key words】  SM22;gastric cancer;RT-PCR

    胃癌是世界范围内发病率较高的肿瘤之一，我国属于胃癌高发地区［1］。已有研究表明［2，3］，胃癌的发生、发展是多因素、多基因变异累积的复杂病变过程。到目前为止，对胃癌最终形成的分子病改变仍不是十分清楚。分离鉴定与胃癌发生、发展有关的分子与基因，寻找胃癌组织与正常胃黏膜的差异，分子标志物对阐明胃癌的发生、发展机制，及对胃癌的预防、诊断与综合都有重要意义。Klade CS等人［4］研究发现SM22蛋白在胃癌中表达上调，有关SM22基因与胃癌发生、发展之间的关系国内外尚未见相关报道。本研究利用RT-PCR技术检测SM22基因在胃癌及正常对照组织中的表达差异。

    1  资料与方法

    1.1  标本来源  胃癌及正常组织标本均取自2002年9月~2003年7月内蒙古医学院附属、内蒙古医院和北京大学附属肿瘤医院胃癌手术切除患者。男35例，女7例；平均（53.67±17.59）岁。标本在手术切除后1h内获得，所有标本均经过临床病理验证，腺癌38例，鳞癌4例。其中配对胃癌组织14例，胃正常组织取自距相应胃癌病灶5cm以上胃黏膜，未配对胃癌组织标本28例。标本在获得后立即放入液氮或-80℃低温冰柜中保存。

    1.2  引物的设计与合成  根据SM22基因cDNA核酸序列设计引物，SM22，上游引物：5 ′―TGG TGA ACA GCC TGT ACC CT―3′，下游引物5′―CAC GGT AGT GCC CAT CAT TC―3′，扩增产物片段长度为235bp。以GAPDH为内对照，上游引物：5′―ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC―3′，下游引物：5′―TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA―3′，扩增产物片段长度为472bp。所有引物均由北京奥科生物技术公司合成。

    1.3  酸性酚―异硫氰酸胍法制备总RNA  0.5g匀浆研碎的组织加2.5ml裂解液，将裂解液倒入10ml离心管中，冰浴10min。加入0.2M醋酸钠/0.1mM ATA  0.25ml，强烈振混，30s×2次。加ATA饱和的酚2.75ml，强烈振混，30s×2次。加24∶1氯仿：异戊醇0.55ml，强烈振混，30s×2次。冰浴15min后，于4℃，10000rpm离心20min。取上清，加1.1ml异丙醇-20℃冰箱沉淀1h。4℃，10000rpm离心20min。弃上清，将沉淀溶于RNA变性液150μl中。加15μl 3M醋酸钠，330μl无水乙醇-20℃冰箱沉淀1h后保存备用。产物用紫外分光光度计测量RNA纯度A260/A280在1.8~2.2之间。

    1.4  RT-PCR及PCR  mRNA逆转录成cDNA（第一链的合成）5μg总RNA 4℃ 12000rpm离心25min，弃上清，洗盐后加入0.2μl/管，用DEPC・H2O稀释成20μl后，70℃变性10min，迅速插冰冷却。加入5×RT缓冲液6μl，dNTP 2μl,Rnasin 0.5μl，混匀，加入M-MLVE 1μl，37℃孵育1h，70℃15min终止反应，-20℃保存备用。PCR反应体系采用20μl PCR反应体系，PCR循环参数：95℃充分变性2min30s；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；循环反应结束后，72℃充分延伸10min；4℃保存。以GAPDH为内对照，每次PCR反应均设阴性、阳性对照。

    1.5  PCR产物鉴定及半定量分析  PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶（含0.25μg/ml EB）电泳（80V，20min），紫外仪下观察PCR产物的含量和特异性。运用AlphalmagerTM2200凝胶成像系统控制的AlphaEaseTM独立软件包照相，并行密度扫描半定量，比较目的片段和内对照产物含量，以SM22与内对照GAPDH密度扫描值的读数之比作为评价SM22基因mRNA表达水平的指标，分析胃癌组织及其相应正常组织的表达差异。

    1.6  统计学方法  使用SPSS 10.0软件进行相关统计学分析，以P＜0.05为统计学显著水平。

    2  结果

    RT-PCR结果显示在42例肿瘤组织中有39例存在SM22 mRNA表达，阳性表达率为92.86%，14例正常对照标本中10例SM22 mRNA表达阳性，阳性表达率为71.43%，胃癌组织中SM22基因表达阳性率与正常对照组相比差异无显著性（见表1）。经过半定量光密度计数后SM22 mRNA在胃癌组织表达量为0.8562±0.141，在14例正常对照标本中为0.3163±0.216，二者差异有显著统计学意义（见表2）。在14对胃癌与正常配对标本中，有10对胃癌及正常组织中SM22基因均表达阳性而且在肿瘤组织中表达量明显高于正常组织。4对标本中SM22 mRNA只在肿瘤组织中表达而在正常组织中不表达（见图1）。

    图1  SM22反转录PCR结果    M：DNA标准带（DNA markers）；T1~7为胃癌组织；N1~7为相应配对正常组织；每个反应体系均以GAPDH为内对照，片段大小为472bp表1  SM22mRNA在胃癌及正常组织中的表达率情况表2  SM22mRNA在胃癌及正常组织中半定量表达情况

    3  讨论

    胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一［1］，大量资料表明胃癌发生可能与p53、c-myc、bcl2等基因有关［2］，但其确切的分子机制尚不明确。因此，鉴定与胃癌发生相关的新基因，对了解胃癌发生的机制有重要意义。SM22蛋白质主要集聚于血管平滑肌［5］。对SM22影响平滑肌细胞的分化和增殖的机制，已经有了相当深入的研究［6，7］。但也有研究表明SM22基因在许多非平滑肌细胞中广泛表达［8］，有关SM22基因与胃癌发生、的关系，目前尚未明确。有研究发现SM22蛋白在胃癌中表达上调［4］。本课题组在前期研究中利用双向电泳检测配对胃癌组织发现SM22蛋白在肿瘤组织中的表达明显高于正常对照组织。本研究采用RT-PCR方法发现SM22 mRNA的表达量在胃癌组织中较高，且与正常对照相比有统计学意义（P＜0.01），提示SM22在胃癌发生中的作用是不容忽视的。

    SM22基因的5′端有445个碱基长的片段，其中含有两个CAnG（CCAAAAAAGG）盒和一个TATA盒的启动子。GAnG盒在很大程度上调控SM22的转录。SRF（serum response factor）是一个CAnG盒的特殊结合蛋白质，SRF-CAnG之间的相互作用受制于若干细胞信号通路的调节，从而进一步影响到SM22的转录。Ras的信号通路是激活SRF-CAnG的一个重要途径之一，Ras基因突变可扰乱细胞代谢和信号传递通路，刺激生长或分化，可导致细胞的恶性转化［9，10］。除了信号通路的调控外，SM22蛋白自身的某些生物化学性质，也可能成为将来研究其致癌机制的方向［11］。有关SM22基因与肿瘤的分子机制的研究还刚刚起步，研究中我们发现SM22基因在胃癌及对照组织中的阳性表达率的差异无统计学意义（P＞0.05），而它在胃癌和对照组织中的表达量却有明显统计学意义（P＜0.01），提示SM22基因的单纯表达率也许并不是特别重要，但它在胃癌和正常组织中表达量的差异，可能是我们特别要关注的。关于胃癌发生中SM22基因高表达的具体原因还有待于进一步研究探讨。综上所述，SM22可能与胃癌的发生有一定的关系，有可能成为诊断胃癌的分子标志物。

    【】

    1  Parkin DM. Global cancer statistics in the year 2000. Lancet Oncol,2001,2:533-543.

    2  Delchier JC, Ebert M, Malfertheiner P.Helicobactor pylori in gastric lymphoma and carcinoma. Curr Opin Gastroenterol,1998,14:41-45.

    3  Fuchs CS, Mayer RJ. Gastric carcinoma. N Engl J Med,1995,6:32-41.

    4  Klade CS, Voss T, Krystek E，et al. Identification of tumor antigens in renal cell carcinoma by serological proteome analysis. Proteomics,2001,1（7）:890-898.

    5  Blanca Camoretti-Mercado, Sean M Forsythe, Michelle M LeBeau, et al. Expression and cytogenetic localization of the human SM22 gene（TAGLN）. Genomics,1998,49:452-457.

    6  Lees-Miller JP, Heeley DH, Smillie LB. An abundant and novel protein of 22 kDa （SM22） is widely distributed in smooth muscles. Purification from bovine aorta. Biochem J,1987,15:705-709.

    7  Gimona M, Sparrow MP, Strasser P,et al. Calponin and SM22 isoforms in avian and mammalian smooth muscle: absence of phosphorylation in vivo. Eur J Biochem,1992,205:1067-1075.

    8  Lawson D, Harrison M, Shapland C. Fibroblast transgelin and smooth muscle SM22 alpha are the same protein, the expression of which is down-regulated in many cell lines. Cell Motil Cytoskeleton,1997,38:250-257.

    9  S Kim, HS Ip, MM Lu, et al. A serum response factor-dependent transcriptional regulatory program identifies distinct smooth muscle cell sublineages. Mol Cell Biol,1997,17:2266-2278.

    10  Barbacid M. Ras genes. Am Rao Biochem,1998,56:779.

    11  Fu Y, Liu HW, Forsythe SM, et al. Mutagenesis analysis of human SM22: characterization of actin binding . J Appl Physiol,2000,11:1985-1990.