乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞AgNORs含量及NK细胞活性相关性
【关键词】 NK细胞
【摘要】 目的 探讨肝炎患者外周血T淋巴细胞AgNORs含量及NK细胞活性变化。方法对198例肝炎患者及30例正常人进行T淋巴细胞AgNORs NK细胞活性及HBV-DNA含量检测。结果乙肝患者随着病情的加重，T淋巴细胞AgNORs含量逐渐降低，急性肝炎患者NK细胞活性与轻度慢性肝炎之间比较无差异外，与其他各型肝炎比较，差异均有非常显著性（P<0.01），各型肝炎间HBV-DNA含量差异无显著性。肝炎患者体内HBV-DNA含量对T淋巴细胞AgNORs含量、NK细胞活性无影响。结论 T淋巴细胞AgNORs含量及NK细胞活性在肝硬化患者中极度降低，可以作为一项监测肝炎患者病情轻重的指标。
关键词 乙型肝炎 AgNORs NK细胞
【Abstract】 Objective To study the change between the quantity of AgNORs in T Lymphocyte cell and NK activity in the peripheral blood of hepatits B.Methods We selected198patients of hepatitis B and30normal peoˉple，whomwere examined the quantity of AgNORs in TLymphocyte cell and NK activity.Results The quantity of AgˉNORs was reduced with the damage of the liver tissue.Among the patients，the NK avtivity changed significantly except the acute and mild patients，the quantity of HBV DNA is not evidently changed.It shows that there is no relation beˉtween the quantity of HBV DNA AgNORs and NK activity.Conclusion The quantity of HBV DNA and AgNORs reˉduced evidently in liver cirrhosis patients，it can be used as a factor to survey the damage of the liver.
Key words hepatitis B AgNORs NK
各种病毒感染均可导致机体免疫系统功能的变化。乙型肝炎病毒（HBV）感染后发的免疫系统改变是一令人普遍关注的问题。而T淋巴细胞及NK细胞则是机体免疫系统内功能最重要的一大细胞群，正常情况下T淋巴细胞及NK细胞群相互作用，维持着机体正常的免疫功能，当T淋巴细胞及NK细胞的活性发生异常时，就可导致机体免疫功能紊乱，并发生一系列的变化，机体的细胞免疫功能状态的好坏又与乙型肝炎病毒的清除密切相关。本课题通过对不同肝炎患者按照病理组织学诊断进行病理分级，来观察肝炎患者间外周血T淋巴细胞AgNORs含量和NK细胞活性变化。
1 资料与方法
1.1 病例选择 198例乙肝病人为我院2001年12月～2003年11月住院病人，病人肝穿诊断标准参照2000年全国第十次（西安）传染病与寄生虫病会议修订的诊断标准。
1.2 实验方法
（1）T淋巴细胞AgNORs活性测定:无菌条件下取0.5ml抗凝血加入含RPMI1640培养液的瓶中，置37℃培养箱中72h，分离T淋巴细胞并低渗破膜后硝酸染色，以核仁呈淡黄色，AgNORs颗粒呈棕褐色为佳。上机用KL型机免疫图像分析系统每例随机检测30个T淋巴细胞核仁银染面积与核面积比例（I・S%），取其平均值为检测结果。（2）HBV-DNA含量检测采用PE5700基因荧光定量诊断系统，报告结果以拷贝/ml表示（试剂为达安基因有限公司）。（3）NK细胞活性采用MTT比色法检测，MTT由瑞士生产，KH562细胞由北京生物所提供，10%SDS液SIGˉMA公司生产。采用密度梯度离心法分离获得PBMC。用培养液调至5×10 6 /ml作为效应细胞，将对数生长期的K502细胞用培养液调至2.5×10 6 /ml作为靶细胞。PG3033A型酶标仪（华东管厂出品）测504nmDD值，结果以百分率表示。计算NK细胞毒活性公式:｛靶细胞-（实验孔DD-效应细胞DD）｝×100%靶细胞
1.3 统计学方法 检验结果以ˉx±s表示，用SPSS8.0软件，以t检验作为显著性检验。
2 结果
2.1 各型肝炎患者外周血T淋巴细胞AgNORs含量、NK细胞活性与HBV-DNA含量之间的比较急性肝炎45例，年龄25～51岁，平均（27±10.9）岁。轻度慢性肝炎39例，年龄19～82岁，平均（41±12.9）岁。中度慢性肝炎52岁，年龄31～67岁，平均（43±11.3）岁。重度慢性肝炎21例，年龄43～83岁，平均（52±10.4）岁。结果显示，急性肝炎T淋巴细胞AgNORs含量与轻度、中度、重度慢性肝炎之间比较，差异有非常显著性（P<0.01）。见表1。急性肝炎患者NK细胞活性除与轻度慢性肝炎之间比较无差异外，与其他各病理分级相比较，差异均有非常显著性（P<0.01），各型肝炎间HBV-DNA含量差异无显著性。
表1 外周血T淋巴细胞AgNORs含量、NK细胞活性与HBV-DNA含量之间的比较
2.2 不同病毒含量对外周血T淋巴细胞AgNORs含量、NK细胞活性的影响 HBV-DNA病毒含量按10 3 ～10 4 、10 4 ～10 5 、10 5 ～10 6 、>10 6 进行分级，分别与T淋巴细胞AgNORs含量、NK细胞活性相比较，差异无显著性（P>0.05），说明肝炎患者体内HBV-DNA含量对T淋巴细胞AgNORs含量、NK细胞活性无影响。见表2。
表2 不同病毒含量对外周血T淋巴细胞AgNORs 含量、NK细胞活性的影响
2.3 肝硬化组与对照组之间T淋巴细胞AgNORs含量、NK细胞活性比较 肝硬化与对照组T淋巴细胞AgNORs含量、NK细胞活性相比较发现，肝硬化组T淋巴细胞AgNORs含量及NK细胞活性明显降低，说明肝炎患者晚期由于病情的加重，抑制了T淋巴细胞的增殖，极大的影响T淋巴细胞的活性，引起机体免疫功能低下或紊乱，导致肝癌的发生。见表3。
表3 肝硬化组与对照组之间T淋巴细胞AgNORs 含量、NK细胞活性比较
3 讨论
T淋巴细胞亚群在细胞免疫乃至整个免疫系统中有着重要的地位。以往由于检测手段的局限性，对T淋巴细胞亚群的检测主要通过流式细胞仪或酶标法对其进行分群，如计数CD3 + CD4 + CD8 + 的数量，通过CD4 + /CD8 + 比值的高低来间接反映机体的免疫状态，并不能反映出T淋巴细胞本身活性的高低。T淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白（AgNORs）是核仁中可被银染的酸性非组蛋白，它可以与组蛋白特异性结合，解除组蛋白对rDNA转录的抑制作用，从 而促进rDNA转录生成rRNA，rRNA是核蛋白体的重要成分，保证蛋白质顺利合成。因此AgNORs含量的高低可以反映rRNA活性的高低，rRNA的转录活性又与细胞内蛋白质合成能力密切相关，蛋白质是细胞发挥其生理功能的物质基础，T淋巴细胞合成蛋白质的能力是T淋巴细胞免疫活性的重要体现，因此，AgNORs的含量可以反映T淋巴细胞的增殖活性，通过检测外周血T淋巴细胞AgNORs的含量可以判断机体的免疫状态 ［1］ 。
本研究对乙型肝炎患者的肝穿标本按照病理分级发现，肝炎患者随着病情加重，NK细胞活性及T淋巴细胞AgNORs含量逐渐降低。在肝硬化患者中，由于肝功能受损、低蛋白血症、营养不良以及肝炎病毒的长期慢性感染，可以出现免疫功能异常，各种细胞因子及致病因子不同程度作用于T淋巴细胞亚群，降低其rRNA活性，表现为T淋巴细胞AgNORs含量极度降低，同时，NK细胞活性降低。导致机体免疫功能低下，不利于体内病毒的清除 ［2］ 。肝硬化患者随着肝功能受损程度的加重，其AgNORs值呈高→低趋势。与对照组间差异有非常显著性（P<0.05）。AgNORs含量的变化与患者病情的变化成正相关。肝硬化病人随病情的加重，由于各种并发症的出现、多种致病因子的作用，存在着各T淋巴细胞亚群之间比例失调，变化更为复杂，其机理有待进一步探讨。以往T淋巴细胞亚群检测是测定T淋巴细胞各亚群数量的变化，而T淋巴细胞AgNORs（I・S%）检测是测定T淋巴细胞的活性变化，可更为准确的反映肝炎患者T淋巴细胞的免疫功能 ［3，4］ 。外周血T淋巴细胞AgNORs测定广泛应用于肿瘤的诊断及预后的判定，本研究中该方法定量地反映肝炎患者T淋巴细胞的免疫功能，且与病情变化密切相关，可以作为肝炎化患者病程以及预后判定的重要指标。
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