大葱油对胃癌细胞株体外培养的影响

【摘要】  　　目的：探讨大葱油对胃癌细胞的影响以及诱导胃癌细胞凋亡的机制. 方法： MTT法评价大葱油对胃癌细胞增殖的影响. 荧光染色观察细胞形态学变化. 流式细胞术和放免法检测细胞凋亡及细胞内游离Ca2+和环磷酸腺苷（cAMP）浓度. 结果：随着大葱油浓度的增加，作用24 h后，细胞增殖抑制率分别达到5.71%，36.33%，44.34%，54.52%和74.15%， IC50≈65 μg/mL. 荧光显微镜下观察结果显示， 实验组出现细胞凋亡形态学变化. 100 μg/mL大葱油作用于胃癌细胞1~12 h， 细胞总凋亡率分别为50.16%， 53.48%， 77.84%， 83.71%和41.34%； 早期细胞凋亡率分别为50.15%, 33.25%, 11.69%，4.65%和0.84%. 100 μg/mL大葱油作用于胃癌细胞5 min~12 h，各相应时间点细胞内游离Ca2+含量依次为(71.00±6.08)，(77.67±1.53), (79.67±1.53)，(83.33±5.03)，(76.00±6.06)，(75.67±2.52)，(72.33±4.24)和(65.00±2.00) nmol/L；细胞内cAMP浓度依次为(5.76±0.36), (18.51±2.06)，(20.40±1.65)，(16.09±1.46)，(12.16±0.78)，(9.88±0.53)，(9.47±0.78)和(9.82±1.06) pmol/mg（P<0.05). 结论：大葱油可抑制胃癌细胞增殖，并通过上调细胞内Ca2+和cAMP水平诱导其凋亡.

【关键词】  大葱油；胃肿瘤；肿瘤细胞，培养的；凋亡；Ca2+；cAMP

　　Effects of Allium fistulosum L. oil on in vitro culture of gastric cancer cell line

　　【Abstract】 AIM: To investigate the effects of Allium fistulosum L. oil (ALFO) on gastric cancer cell line and the possible signal molecular mechanism underlying apoptotic process induced by AFLO. METHODS: Human gastric cancer MGC80?3 cells were cultured in vitro and treated by AFLO. Then its growth inhibitory rate was counted and IC50 was measured. Apoptotic process was investigated with fluorescence microscope. Intracellular?free cal?cium content at different times was determined by flow cytometry. Intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels were determined by radioimmunoassay (RIA). RESULTS: With increasing the concentration of AFLO, cell growth inhibitory rates went up correspondingly 24 h after treatment with AFLO and reached 5.71%, 36.33%, 44.34%, 54.52% and 74.15% respectively. IC50≈65 μg/mL. Hoechst 33258 fluorescent staining showed that apoptosis appeared in some cells treated by AFLO (100 μg/mL). When MGC80?3 cells were incubated in the pre?sence of AFLO (100 μg/mL) from 1 to 12 h, the total apoptotic rates were 50.16%, 53.48%, 77.84%, 83.71% and 41.34%, respectively, and the early apoptotic rates were 50.15%, 33.25%, 11.69%, 4.65% and 0.84%, respectively. In MGC80?3 cells treated by AFLO (100 μg/mL) for 5 min to 12 h, free calcium contents were (71.00±6.08), (77.67±1.53), (79.67±1.53), (83.33±5.03), (76.00±6.06), (75.67±2.52)，(72.33±4.24) and (65.00±2.00) nmol/L, respectively and cAMP concentrations were (5.76±0.36), (18.51±2.06), (20.40±1.65)，(16.09±1.46)，(12.16±0.78)，(9.88±0.53)，(9.47±0.78)，(9.82±1.06) pmol/mg, respectively. CONCLUSION: AFLO can inhibit the growth of gastric cancer cell line MGC80?3 and induce the apoptosis through increasing intracellular Ca2+ and cAMP levels.

　　【Keywords】  Allium fistulosum L. oil; stomach neoplasms; tumor cells, cultured; apoptosis; Ca2+; cAMP

　　0 引言

　　大葱属百合科葱属， 其挥发油成分主要为含硫化合物、 不饱和脂肪酸、 萜烯类化合物， 约占其总含量的90%［1］. 有研究表明大葱提取物具有抗肿瘤细胞活性［2］， 但相关的作用机制少见报道. 我们通过观察大葱油对胃癌细胞增殖及凋亡的影响， 从信号传导通路的角度探讨大葱油诱导胃癌细胞凋亡可能的作用机制.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　噻唑蓝（MTT），双苯甲亚胺（Hoechst33258），钙荧光指示剂Fura?2/AM(美国Sigma公司)；碘化丙啶?磷脂酰丝氨酸外翻分析（PI?Annexin V）细胞凋亡检测试剂盒(北京保赛生物技术有限公司)；125I?环磷酸腺苷（cAMP）检测试剂盒(上海中医药大学同位素室)；FACSCALIBUR流式细胞仪(美国Becton Dickinso公司)；FJ?2021型γ?放射免疫仪( 西安核仪器厂)；DG3022A型酶联免疫检测仪(南京华东管厂)；BHF?142型荧光显微镜(日本Olympus公司)，人胃低分化黏液腺癌MGC80?3细胞株由河北医科大学细胞生物室惠赠.

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养参照［3］的方法进行细胞培养.

　　1.2.2 大葱油的制备

　　用本地产无农药污染的新鲜大葱去皮去叶，取葱白部分，用常压蒸馏法提取挥发油. 取大葱挥发油1 g，吐温80 2 g，加无菌去离子水至100 mL，制成10 g/L的大葱油乳剂，0.22 μm微孔滤膜滤过除菌，置4℃冰箱保存.

　　1.2.3 MTT法检测

　　参照文献［4］的方法进行. 吐温80组（对照组）：吐温80浓度分别为200，150，100，50和25 μg/mL；大葱油组（实验组）：大葱油浓度分别为100，75，50，25和12.5 μg/mL，每组8个孔. 加药后继续培养24 h，用酶联免疫检测仪在波长490 nm处测各孔的吸光度值（A值），增殖抑制率：IR（%）=(1-实验组A值/对照组A值)×100%，绘图测半数抑制浓度IC50.

　　1.2.4 胃癌细胞凋亡形态观察

　　采用Hoechst 33258荧光染色，取生长状态良好的胃癌MGC80?3细胞，消化计数，以5×104个/孔接种于24孔板中，常规培养24 h后加药. 对照组：吐温80浓度200  g/mL，实验组：大葱油浓度100 μg/mL，每孔分别加入1 mL，作用1，2，3，6和12 h后吸出培养液，PBS冲洗2遍，点加Hoechst 33258染色液，10 min后再用PBS冲洗2遍，用滤纸沾去多余的液体，用荧光显微镜观察并照相.

　　1.2.5 PI?AnnexinV凋亡检测

　　取生长状态良好的MGC80?3细胞，对照组：吐温80 200 μg/mL终浓度，实验组：大葱油100 μg/mL终浓度，培养1，2，3，6和12 h后，吸出培养液，25 g/L胰蛋白酶消化，PBS洗涤2遍，将细胞重新悬浮于200 μL结合缓冲液中，加入10 μL荧光素标记的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白（AnnexinV?FITC）和5 μL碘化丙啶，轻轻混匀，闭光室温反应15 min，加入300 μL结合缓冲液，立即用流式细胞仪检测.
 
　　1.2.6 细胞内游离Ca2+浓度测定

　　取生长状态良好的胃癌MGC80?3细胞，对照组：吐温80 200 μg/mL终浓度，实验组：大葱油100 μg/mL终浓度，培养5，15，30 min，1，2，3，6和12 h后，弃去培养液，PBS洗涤1遍，用25 g/L胰蛋白酶消化，PBS洗涤2遍，加PBS 4 mL吹打成单细胞悬液，取细胞约1×106个， 1×103 r/min，离心5 min，倒去上清液，留0.1~0.2 mL，每个样品加入终浓度5 μmol/L Fura?2/AM，闭光室温孵育15 min，用PBS洗去未结合染液，离心，去上清液，加PBS 1 mL使细胞悬浮，500目铜网过滤至样品管中，立即用流式细胞仪检测，激光激发波长为488 nm.

　　1.2.7 细胞内cAMP浓度检测

　　取生长状态良好的胃癌MGC80?3细胞，对照组：吐温80 200 μg/mL终浓度，实验组：大葱油100 μg/mL终浓度，培养5，15，30 min，1，2，3，6和12 h后，吸出培养液，0.2 mol/L 醋酸缓冲液洗涤2遍，每孔加入0.2 mol/L醋酸缓冲液（pH=4.75）1 mL，用细胞刮刀将细胞轻轻刮下，放入离心管中，反复冻融4~5次，显微镜下观察无完整细胞后，0℃，1×104 r/min，离心30 min，取上清液-70℃冻存待测. 按照125I?cAMP检测试剂盒说明作标准曲线，测定每一样品的cAMP含量，用考马斯亮兰G250法测同一标本的蛋白含量，计算样品cAMP浓度（pmol/mg）.

　　统计学处理：采用SPSS 11.0软件进行统计处理，所用统计分析方法采用方差分析和t检验.

　　2 结果

　　2.1 大葱油对胃癌细胞增殖的影响

　　胃癌MGC80?3细胞经大葱油100，75，50，25和12.5 μg/mL各浓度作用24 h后，细胞增殖抑制率分别达到74.15%，54.52%，44.34%，36.33%和5.71%，随着大葱油浓度的增加，对胃癌MGC803细胞的增殖抑制率逐渐增加，除大葱油12.5 μg/mL实验组外，其他各实验组A值与对照组相比较，差异具有统计学意义（P<0.05），IC50≈65 μg/mL, n=8(图1).

　　2.2 凋亡胃癌细胞的形态观察

　　大葱油100 μg/mL作用于胃癌MGC80?3细胞1~12 h后，Hoechst 33258荧光染色. 荧光显微镜下观察结果显示，对照组细胞核呈弥散均匀的荧光，提示为正常活细胞，大葱油作用于胃癌MGC80?3细胞1 h后，可观察到实验组部分细胞的细胞核或细胞质内出现浓染致密的块状或颗粒状荧光，提示细胞核固缩，染色质凝集，DNA片段化，细胞出现凋亡，大葱油作用时间越长，凋亡表现越明显（图 2）.

　　2.3 大葱油对胃癌细胞凋亡的影响

　　100 μg/mL大葱油作用于胃癌MGC80?3细胞1， 2， 3， 6和12 h， 胃癌MGC80?3细胞总凋亡率分别为： 50.16%， 53.48%， 77.84%，83.71%，41.34%；早期凋亡率分别为：50.15%，33.25%，11.69%，4.65%，0.84%，峰值出现在1 h，胃癌MGC80?3细胞凋亡率为9.65%.

　　2.4 细胞内游离Ca2+浓度测定

　　大葱油100 μg/mL终浓度作用5 min后胃癌MGC80?3细胞内游离Ca2+浓度明显高于对照组，于1 h达高峰，之后开始下降，但仍高于对照组，各时间点差异均有统计学意义(P<0.05，表1).表1不同时间细胞内游离Ca2+浓度(略)

　　2.5 细胞内cAMP浓度测定

　　胃癌MGC80?3细胞经大葱油100 μg/mL培养5，15，30 min，1，2，3，6和12 h后，测定cAMP浓度. 结果显示实验组分别为：（5.76±0.36），（18.51±2.06），（20.40±1.65）， （16.09±1.46）， （12.16±0.78）， （9.88±0.53）， （9.47±0.78）和（9.82±1.06） pmol/mg；对照组分别为（5.89±0.38）， （6.08±0.76）， （5.93±0.67）， （5.12±0.41）， （5.17±0.42）， （5.89±0.21）， （5.87±0.66）和 （5.74±1.05） pmol/mg. 药物作用后15 min胃癌MGC80?3细胞内cAMP浓度呈上升趋势，30 min达到高峰，之后cAMP浓度逐渐下降，但仍然高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05，图3).

　　3 讨论

　　大葱油中的多种有效成份已被证实具有抗癌作用，但与其抗癌机制及其信号转导途径有关的研究目前尚处于起步阶段. Ca2+和cAMP是细胞内重要的第二信使，多项实验结果显示药物诱导胃癌细胞凋亡时，伴随着Ca2+和cAMP的升高，二者在胃癌细胞的凋亡过程中具有重要的作用，其升高可诱导胃癌细胞凋亡［5］. 本研究中，我们检测了大葱油作用后不同时期胃癌细胞的凋亡率，同时测定胃癌细胞凋亡各阶段细胞内Ca2+和cAMP浓度的动态变化，证实大葱油作用早期胃癌细胞内Ca2+浓度即有上升，说明Ca2+在诱导胃癌细胞凋亡的信号传导过程中确实发挥作用，与研究报道胃癌细胞凋亡时Ca2+浓度的变化结果一致［6］. 细胞内cAMP浓度在给药后明显上升，说明cAMP也参与大葱油诱导胃癌细胞凋亡的信号传导过程. 随即cAMP下降明显，在整个实验过程中均明显高于对照组，与其他相关报道略有不同［7］. 另外，Ca2+和cAMP之间存在着相互调节，Ca2+?钙调蛋白复合体能够结合并调节腺苷酸环化酶和cAMP磷酸二酯酶的活性，低浓度的Ca2+激活腺苷酸环化酶，高浓度则抑制其作用，而激活磷酸二酯酶. 反之，cAMP依赖性激酶PKA可使钙通道磷酸化，引起细胞外Ca2+内流，从而使细胞内Ca2+浓度升高［8］. 大葱油作用后细胞内cAMP浓度峰值出现在早期凋亡率峰值及Ca2+浓度峰值出现之前， 提示早期cAMP浓度升高后可能进一步促进Ca2+浓度上升， 然后通过后者或共同发挥介导、 启动和促进胃癌细胞凋亡的作用.

　　综上所述，本研究结果提示，大葱油可通过上调细胞内第二信使Ca2+和cAMP的水平来诱导胃癌细胞凋亡，为其药用价值的开发提供了思路.

【】
  　　［1］黄雪松. 大葱挥发油含量与化学成分的分析［J］. 食品与发酵，2004，30(10)：114-117.

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　　［4］甘泉，辛晓燕，刘玉，等. 紫杉醇诱导人子宫内膜癌细胞增殖凋亡的实验研究［J］. 第四军医大学学报，2006，27（17）：1620-1623.

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