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人参皂甙Rg1和Rb1对脐血CD34+细胞凋亡的影响

来源：岁月联盟作者：时间：2010-07-14

作者：郭若霖万晓华陈晓建谈志龙王学谦

【关键词】 人参皂甙

【摘要】目的探讨人参皂甙Rg1和Rb1对体外培养体系中撤除细胞因子引起的脐血CD34 ⁺ 细胞凋亡的干预作用。方法免疫磁珠法纯化获得脐血CD34 ⁺ 细胞，在含有TPO（50μg/L）、SCF（50μg/L）的StemSpan^TM SFEM无血清液体培养基中培养7天后，撤除细胞因子实验组加入不同浓度Rg1、Rb1，24h和72h后收集细胞，流式细胞仪FITC-Annexin-V/PI双色荧光标记检测细胞凋亡率，比色法检测Caspase-3活性。结果撤除细胞因子24h后，撤因子组细胞凋亡率为（24.79±2.80）%，Rgl（2.5mg/L、5mg/L、10mg/L）各组细胞凋亡率均降低，分别为（12.35±2.07）%、（11.87±1.20）%和（13.91±0.50）%（P<0.01）;Rb1各组（5mg/L、10mg/L）的细胞凋亡率分别为（17.88±0.65）%、（20.61±0.85）%（P<0.01）;撤除细胞因子24h和72h对照组，Caspase-3活性设为1.00，Rg1-2.5组（0.72±0.09，0.57±0.22，P<0.01），Rg1-5组（0.51±0.11，0.42±0.10，P<0.01），Rg1-10组（0.63±0.06，P<0.01;0.83±0.12，P>0.05），Rb1-5组（0.54±0.18，0.32±0.18，P<0.01）Rb1-10组（0.87±0.07，P>0.05;0.55±0.03，P<0.01），Caspase-3活性均低于对照组。结论人参皂甙Rg1、Rb1能拮抗因撤除细胞因子诱导脐血CD34⁺ 细胞凋亡，此作用与Caspase-3信号通路有关。

关键词细胞凋亡脐血CD34 + 细胞 Caspase-3 人参皂甙.

【Abstract】 Objective To investigate the effects of ginsenosides Rg1and Rb1during umbilical cordal blood hematopoietic cells apoptosis induced by growth factors withdrawal.Methods Human umbilical cordal blood CD34 + stem cells were purified and obtained steriley.CD34 + cells were cultured in StemSpan TM SFEM serum-free medium containing cytokines TPO（50μg/L）and SCF（50μg/L）for7days.Then cells were collected and maintained in the same medium with the growth factors deprivation for24h and72h.The experimental groups were respectively treated with Rg1or Rb1with different concentrations.FITC-Annmexin-V/PI flow cyloanalyzer and Caspase-3colorimetˉric assay were respectively used to determine cell apoptosis rate and the activity of Caspase-3.Results 24hours afˉter the cytokines withdrawal，the apoptosis rate in control cells was（24.79±2.80）%;the apoptosis rate in Rg1（2.5 mg/L，5mg/L，10mg/L）groups were（12.35±2.07）%，（11.87±1.20）%and（13.91±0.50）%（P<0.01）;in Rb1groups（5mg/L，10mg/L）were（17.88±0.65）%，（20.61±0.85%）（P<0.01）respectively.24hours and72hours after cytokines deprivation，Caspase-3activities in control groups were taken as1.00，the values in Rg1-2.5group were0.72±0.09and0.57±0.22（P<0.01），in Rg1-5group were0.51±0.11and0.42±0.10（P<0.01），in Rg1-10group were0.63±0.06（P<0.01）and0.83±0.12（P>0.05）;in Rb1-5group were0.54±0.18and0.32±0.18（P<0.01），in Rbl-10group were0.87±0.07（P>0.05），0.55±0.03（P<0.01）.Conclusion These results demonstrated that apoptosis induced by growth factors withdrawal of umbilical cordal blood hematopoietic cells can be inhibited by Rg1and Rb1and this effect was involved with Caspase-3signal pathway.

Key words apoptosis umbilical cordal blood CD34 + cells caspase-3 ginsenosides

细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序的一种主动性的死亡过程，它涉及细胞内一系列的信号转导和调控过程。在造血过程中，细胞凋亡在调控细胞增殖、分化的平衡中起重要作用。人参“补气养血”的功效虽然已经在临床上应用已久，但机理并未阐明。近年来对人参的主要成分人参皂甙的研究很多，多集中在促进 ˇ 基金项目:天津市科委基金资助项目（编号:013608511）造血祖细胞增殖，诱导髓性白血病细胞凋亡，增强机体免疫功能等方面。国内学者研究发现人参皂甙不但能促进造血干/祖细胞增殖，并且能诱导定向分化^［1］。但人参皂甙Rg1和Rb1对造血干细胞凋亡的影响尚未见报道。本研究观察了人参皂甙Rg1和Rb1对撤除细胞因子引起的脐血造血细胞凋亡的拮抗作用，以期在细胞水平上为人参皂甙“补气养血”功效的作用机制提供更多的实验室证据。

1 材料与方法

1.1 标本来源脐血采自天津医科大学第二附属和天津市中心妇产科医院，无菌条件下采集正常足月分娩的胎儿脐带血，母亲和新生儿均应健康，肝素抗凝。采集后4h内用相对密度为1.077的Ficoll淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞（MNC），洗涤，计数备用。

1.2 CD34 ⁺ 细胞的分离及纯度分析利用德国Miltenyi Biotec公司CD34 ⁺ 细胞单克隆抗体免疫磁珠分离系统（MACS）分离富集CD34 ⁺ 细胞备用。分离方法依试剂盒说明书进行。流式细胞仪检测CD34 ⁺ 细胞纯度:取纯化后细胞3×10 ⁴加入10μl FITC-CD34荧光抗体，阴性对照为FITC-IgG荧光抗体（BD公司产品），用FACScan（BDIS公司）流式细胞仪分析，结果用LysisⅡ软件处理。

1.3 CD34 ⁺ 细胞液体培养扩增取24孔板，StemSpan ^TMSFEM无血清液体培养基建立1ml/孔培养体系，CD34 ⁺ 细胞5×10 ⁴ 个/孔，每孔加入细胞因子TPO50μg/L、SCF50μg/L，置于37℃、5%CO ₂ 、100%饱和湿度的CO ₂ 孵箱中，培养7天。收集细胞，PBS洗涤2遍后悬浮于MACS缓冲液中，台盼蓝染色计数细胞总数。

1.4 人参皂甙Rg1和Rb1撤除细胞因子引起脐血细胞凋亡的干预作用 24孔板中，取扩增7天后脐血细胞5×10 ⁴ 个/孔，1ml/孔，撤因子组不加任何细胞因子;人参皂甙干预组加入不同浓度的Rg1（2.5mg/L、5mg/L、10mg/L），分别设为Rg1-2.5组，Rg1-5组，Rg1-10组;不用浓度的Rb1（5mg/L、10mg/L），分别设为Rb1-5组，Rb1-10组，混匀，撤因子组设6个复孔，其他每组设3个复孔。置于37℃、5%CO ₂ 、100%饱和湿度的CO ₂ 孵箱中，分别取培养24h和72h的适量细胞，以备用于细胞凋亡检测。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率撤除细胞因子培养24h后，各取1×10 ⁶个细胞，PBS洗涤，并用1×Binding Buffer（试剂盒中提供）使浓度为1×10 ⁶ 个/ml;转移1×10 ⁵ 个细胞（100μl）到5ml流式专用管，另取等量3管细胞做对照管;实验管加入5μl FITC-Annexin-Ⅴ和5μl PI，3个对照管:（1）只加5μl FITC-Annexin-Ⅴ;（2）只加5μl PI;（3）两者都不加;混匀，25℃避光孵育15～30min;各管加入400μl1×Bindˉing Buffer，1h之内用流式细胞仪CellQuest软件分析，观察Annexin V ⁺ /PI ^- 早期凋亡细胞群，检测细胞凋亡率。