Ecoli和Yeast菌体蛋白ELISA定量测定方法的建立

【关键词】  ,菌体蛋白；酶联免疫吸附测定；紫外线辐照；葡萄球菌A蛋白；生物素

　　［摘要］ 目的：提高酶联免疫吸附测定（ELISA）方法的灵敏度。方法：将聚苯乙烯微孔板（PS）经过紫外线（UV）辐照后，用葡萄球菌A蛋白（SPA）预包被，再应用生物素链霉亲和素（BSA）反应建立双抗体夹心ELISA。结果：检测低限为1.95 ng/ml,方法的批内变异分别为7.96%和8.63%。结论：为菌体蛋白的测定提供了一种新的方法。

　　［关键词］ 菌体蛋白；酶联免疫吸附测定；紫外线辐照；葡萄球菌A蛋白；生物素链霉亲和素

　　Establishment of ELISA for the Quantitative Detection of Ecoli and Yeast

　　Absract：Objective Improve the detective sensitivity of enzymelinked immunosorbent assay(ELISA)method.Methods Precoating staphylococcal protein A(SPA)on UVirradiated PS plate,then applying biotinStreptavidin system to establish a kind of sandwich ELISA method.Results The detectable lower limit is 1.95 ng/ml,the within run CV are 7.96% and 8.63%.

　　Key words：Bacterioprotein;ELISA;UAirradiation;SPA;BiotinStreptavidin

　　酶免疫测定（enzyme immunoassay,EIA)是将酶促反应的高效率与免疫反应的高度专一性有机地结合起来，可对生物种体内各种微生物分子（抗原/或抗体）进行定性或定量分析，广泛应用于生物和医学实验诊断领域［1］。大肠杆菌（Ecoli)和酵母菌（Yeast)分别为原核和真核细胞微生物，具有代表性，为了提高对微生物分子检测的灵敏度，我们在改善固相模式的基础上，利用生物素链霉亲和素（BSA）放大系统，建立了检测菌体蛋白的ELISA方法。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要试剂与仪器　　　　　　　

　　大肠杆菌（Ecoli)、酵母菌（Yeast)菌体蛋白（浓度均为10 mg/ml),由上海万兴生物制品公司提供；多克隆兔抗Ecoli、兔抗Yeast、山羊抗Ecoli和山羊抗Yeast、辣根过氧化物酶标记的羊抗Ecoli(HRPGAEcoli)和羊抗Yeast(HRPGAYeast)由南京军区南京总提供；生物素N羟基琥珀酰亚胺酯（BNHS）由美国Sigma公司生产，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（StreptavidinHRP)(编号BA 1088）购自博士德生物工程有限公司，葡萄球菌A蛋白（SPA）购自上海生物制品研究所，其他所用化学试剂均为国产分析纯。BIORAD Model 550酶标仪。

　　1.2　山羊抗EColi和山羊抗Yeast IgG组分的纯化　　　　　　　
　　采用50%饱和硫酸铵盐析法提取［2］，生理盐水溶解后用pH 7.4 0.01 mol/L磷酸盐（PBS）缓冲液透析，定蛋白量备用。

　　1.3　生物素标记山羊抗Ecoli和山羊抗Yeast［3］　　　　　　　
　　将上述纯化的山羊抗Ecoli 和山羊抗Yeast用pH 8.8 0.1 mol/L硼酸缓冲液透析，用无水DMSO配制10 mg/ml生物素N羟基琥珀酰亚胺酯溶液，按照75 μg/ml的氯化铵（用pH7.4 0.01 mol/LPBS配制），室温孵育10 min，完毕后用PBS透析，并加入适量的中性甘油于-20 ℃低温冷冻保存，其工作浓度用方阵滴定法进行确定。

　　1．4　Ecoli和Yeast菌体蛋白检测实验条件　　　　　　　
　　包被液：pH 9．6 0．05 mol／L碳酸盐缓冲液；洗涤液：pH 7．4 0．01 mol／L PBSTween20；稀释液：10％小牛血清(用pH 7．4 0．01 mol／LPBS配制)。用方阵滴定法摸索固相分子SPA的最适包被浓度和兔抗Ecoli与兔抗Yeast抗体的最适反应浓度。先用SPA分子预包被，再分别与兔抗Ecoli、兔抗Yeast反应而固相至微孔板表面，采用上述稀释液进行封闭，至此即可用菌体蛋白的测试。具体步骤如下：将一系列标准浓度的菌体蛋白分别加入到包被好的微孔板内，每孔100 μl，于37 ℃反应1 h，洗涤，空干后分别加入其相应的生物素标记山羊抗Ecoli和Yeast抗体(BiotinGAEcoli和BiotinGAYeast，工作浓度预先摸索)，每孔100 μl，37 ℃反应1 h，洗涤，加入StreptavidinHRP，每孔100 μl，37 ℃反应1 h，洗涤后加入酶底物过氧化脲(底物A)和四甲基联苯胺(TMB：底物B)，每孔各50 μl，于室温避光显色10 min，用2 mol／LH2SO4终止反应，于450 nm／630 nm双波长下测定吸光度值，依据提供的标准菌体蛋白浓度，绘制标准曲线，相关系数(r)，选择线性关系好，灵敏度高的实验条件。

　　1．5　精密度测定　　　　　　　

　　分别将两种菌体蛋白标准用样本稀释液从500 ng／ml连续倍比稀释10次，每个浓度加样6孔按照选定的实验条件进行反应，以酶标仪测定吸光度A值，计算变异系数。

　　2　结果

　　2．1　最佳实验条件　　　　　　　

　　经方阵滴定和比较不同的反应条件，确定实验测试的最佳反应条件为：2．5 μg／ml的SPA预包被，每孔10 μl，于37 ℃ 2 h后，再置4 ℃冰箱过夜，洗涤3次，5 min／次，再分别与兔抗E．coli、兔抗Yeast(均用PBS配制浓度为10 μg／ml)反应，37 ℃ 1 h，同上洗涤，用每孔150 μl的10％小牛血清进行封闭，37 ℃ 2 h，置4 ℃冰箱过夜，同上洗涤。BiotinGAE．coli和BiotinGAYeast的最佳工作浓度分别为5 μg／ml和2．5 μg／ml，StreptavidinHRP的工作浓度前者为1∶2 000，后者为1∶3 000，HRPGAE．coli与HRPGAYeast的工作浓度分别为1∶3 500和1∶1 500，反应均为37 ℃ 1 h加样量为每孔100 μl，洗涤3次，5 min／次。

　　2．2　灵敏度、标准曲线与精密度　　　　　　　

　　在建立方法的过程中，为了提高对菌体蛋白所测结果的敏感度，在采用SPA+兔抗分子固相模式的基础上，应用生物素链霉亲和素的放大效应，使灵敏度更加提高，所测结果较为满意，对两种菌体蛋白的最低检出量均可达到1．95 ng／ml。吸光度值较直接用GAHRP传统反应模式所测结果增高，其中尤以高浓度部分增高最为显著(见图1，图2)。在含量3．9 ng／ml~500 ng／ml范围内，二次方程(y=a+bx+cx2)线性关系良好，相关系数(r)均大于0．990。对两种蛋白测定的批内变异系数分别为7．96％和8．63％。

　　3　讨论

　　在建立方法过程中，用传统的双抗体夹心模式（兔抗分子直接包被）对菌体蛋白所测结果敏感度和线性范围均不理想。传统方法（直接吸附法）固相的免疫球蛋白（Ig)分子除了呈团串状，不均一分布和易解吸等不利表现外，Ig分子摊开在载体表面，不但构象发生改变，而且影响Ig的活性。本文采取SPA+兔抗分子固定模式，将SPA预包被于经过紫外灯辐照的聚苯乙烯微孔板(PS)［4～6］。葡萄球菌A蛋白(SPA)是金黄色葡萄球菌一种胞壁成分，由单一肽链组成，分子中有4个高亲和力结合IgG抗体的Fc片段位点，具有较好的热稳定性和抗变性作用而保持其天然构象，将其预先包被至固相，则特异性抗体IgG(单克隆或多克隆)即可与SPA结合而间接吸附于载体表面，改善了固相抗体分子的功能化保留程度，能够捕获较多菌体蛋白分子。PS板经UV辐照后，基底表面发生了氧化并引入了含氧的活性基团，O／C元素比较辐照前提高了6．9倍，改善了对抗原生物分子的亲水和化学反应性能，此亦即UV辐照PS板改善对抗原分子固定效果的主要原因。这种固相模式使包被的蛋白分子空间取向与分布较为均匀一致，后续测定结果显示出高度的敏感性和重复性。本文在改进了固相模式的基础上，再利用BSA放大系统改进了液相的反应模式，众所周知，1个亲和素分子可与4个生物素分子结合，链霉亲和素与生物素分子的亲和力是一般抗原抗体亲和力的一百万倍［7］，比直接用HRP标记羊抗菌体蛋白反应模式灵敏度大大提高。在用生物素标记山羊抗Ecoli和山羊抗Yeast前应先生物素酯分子与抗体分子的比率，在大多数情况下，推荐两者的比率约为4∶1。高浓度的生物素酯会导致多个生物素分子结合在抗体上，较低的比率则会使生物素化保持在最低限度。标记后的抗体溶液要用PBS透析，以除去未结合的生物素，由于生物素分子较大，故透析时间宜延长。在实验过程中要注意避免污染，如大肠杆菌和酵母菌的污染对本实验影响较大，尤其是样本稀释液(即10％小牛血清)，因为实验过程中，封闭液、标准浓度的菌体蛋白、生物素标记的山羊抗体、StreptavidinHRP均用10％小牛血清进行稀释，样本稀释液的污染直接会导致菌体蛋白含量的变化，影响倍比稀释浓度梯度，不能获得满意的实验结果。

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　　［1］杨利国，胡少昶，魏平华，等．酶免疫测定技术［M］．南京：南京大学出版社，1998：210．

　　［2］武建国．实用临床免疫学检验［M］．第2版．南京：江苏技术出版社，1990：1320．

　　［3］沈关心，译．抗体技术实验指南［M］．北京：科学出版社，2002：5960．

　　［4］虞伟，顾宁，武建国．固相功能化免疫分子层的制备与形貌表征［J］．临床检验杂志,2001，19(6)：372．

　　［5］虞伟，孙永康，廖建辉，等．UV辐照聚苯乙烯微孔板用于酶免疫测定的研究与表征［J］．生物化学与生物物理进展，2002,29(3)：479.

　　［6］Ngai P K M,Ac Kermann F,Wendt H，et al.Protein A antibodycapture ELISA(PACE):an ELISA format to avoid dinaturation of surfaceadsorbed antigens［J］.Journal of Immuno logical Methods,1993，158：267276．

　　［7］程振球，章谷生．链霉亲和素的特性及其应用［J］．上海免疫学杂志，1992，12(1)：56．