骨组织电镜脱钙技术在免疫组化中的应用
作者：朱礼国，汤显斌，张健，赵伦华，程少华
【关键词】 骨组织
［关键词］ 骨组织；电镜；脱钙
骨组织的免疫组化一直是病理技术中的一大难题。由于骨组织中60％以上为钙盐组成的羟基磷灰石结晶，因而骨组织固定、脱钙都是制备标本的重要环节。一些强酸如盐酸、硝酸等虽能快速有效除去骨组织中的钙盐，但对其中的抗原蛋白也产生了致命性破坏［1，2］;近几年的微波辅助EDTA脱钙技术［3］，虽然可实现较好地保护组织抗原性且快速的效果，但操作程序复杂。骨组织的电镜制片技术对组织固定与脱钙要求均远高于常规染色与免疫组化，其脱钙液与固定液均与其他方法有较大差别，本实验用该方法进行骨组织免疫组化，取得了较理想的效果，现报道如下。
1 材料与方法
1．1 材料
健康成年日本大耳白兔60只，体重(2.5±0．25)kg，雌雄不限，根据实验要求分为对照组与对照组；由武汉大学动物实验中心提供。一抗为兔VEGF单克隆抗体，美国Neo Markers公司(Ab3，JH121)；二抗为鼠抗兔VEGF单克隆抗体，迈新公司(KIT9701SPMouse)试剂盒。
1．2 固定液配制
固定液配方如下：多聚甲醛2 g，蒸馏水25 ml，lN氢氧化钠1滴~3滴，25％戊二醛10 ml，依次加入后加入0．2 mol磷酸缓冲液至50 ml［4］。
1．3 脱钙液配制
脱钙液配方如下EDTA2 Na 40 g~50 g，蒸馏水500 ml，0.2 g NaOH 350 ml，再加蒸馏水至1 000 ml［4］。
1．4 组织处理程序
实验结束后处死大白兔，取后腿骨，将股骨头沿正中冠状面劈开，然后将其截成0．5 cm×0．3 cm×0.2 cm大小骨片，生理盐水清洗后立即投入强冷后固定液中，4 ℃固定12 h~24 h；固定结束后骨片在0．2 mol磷酸缓冲液中充分漂洗后，投入脱钙液中，4 ℃下脱钙，每日检查脱钙情况，直至骨片脱钙完全为止，密质骨大约3周~4周，松质骨约7 d~10 d;脱钙结束后，骨片用蒸馏水冲洗20 min，然后进入常规脱水处理程序并包埋、切片。
1.5 免疫组化
按照试剂盒说明，进行常规SP免疫组化操作。
2 结果
正常兔股骨头VEGF免疫组化染色以胞浆和(或)胞膜、核膜有明确棕黄色着色者为阳性细胞，VEGF阳性部位主要位于胞浆，(见图1)。实验组动物股骨头中可见成骨母细胞呈多层粘贴在骨小梁表面，并成批演化为骨细胞，同时在染色阴性的区域出现点状新生的毛细血管(见图2)，所有切片染色均无背景，阳性病例显色强，定位准确。
3 讨论
免疫组化效果好坏关键取决于抗原保持的结果，这就需要在组织制片过程中将抗原最大程度地保护好。因骨组织含有大量的钙盐，组织较致密，在制片前要延长固定时间并经历漫长脱钙处理过程，而大多数酸性脱钙液对抗原均有破坏作用，而且脱钙时间过长又进一步不利于抗原性的保护。鉴于上述原因，强酸快速脱钙在骨组织免疫组化中已被弃用。近些年出现的微波(MW)-EDTA快速脱钙技术虽可使脱钙时间缩短为8 h~10 h［5］，但操作程序比较复杂，脱钙时需较好地控制脱钙液温度不能超过15 ℃，否则也易导致假阴性，背景色深等缺点［6］。因此，在时间要求不紧迫的前提下，该方法也不应是首选。电镜制片过程中由于要极大程度地保存组织的超微结构，因此骨组织的电镜制片过程中必然最大限度地保护抗原不受破坏，从而对免疫组化大有裨益；本实验中固定液中含有多聚甲醛与戊二醛，前者具用较强的穿透力，可以缩短固定时间，而戊二醛对蛋白及糖原有较好的固定作用，且在4 ℃条件下进行固定，这样最大程度地减少了组织自溶与抗原弥散；脱钙液中主要成分是EDTA，其脱钙作用较温和，对组织没有损伤；因该步骤时间较长，必须尽可能去除脱钙液中一切可能对组织有破坏作用的因素。脱钙液中少量NaOH就起到中和残留在组织中的固定液中的酸性物质，此外脱钙液的温度也是影响抗原性保持的重要因素，尽管高温有利于缩短脱钙时间，但会加速抗原弥散，因此在4 ℃条件下进行脱钙是合适的选择。经本方法固定、脱钙后的骨组织用于免疫组化的最大优点是最大限度地保护了组织的抗原性，因此取得了比较完美的结果。
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