宫颈病变中HPV替代标志物研究

【关键词】  宫颈病变；HPV；替代标志物

　　［摘  要］ HPV作为宫颈病变标志物研究已取得了很大的进展，但其作为筛查指标特异性和灵敏度还不够，近年来宫颈颈癌发生和肿瘤进展的分子机制成为研究的热点，本文对HPV的几个替代标志物p16INK4a、cyclin E、端粒酶、Ki-67、PCNA和中心体数目进行了综述。

　　［关键词］宫颈病变；HPV；替代标志物

    宫颈癌的HPV相关致瘤基因的细胞基因的异常表达分析可替代HPVDNA试验。HPVE6和E7蛋白与包括许多细胞生长和分化调节细胞因子间的相互作用，HPV和宿主细胞器间的复杂的交互作用是宫颈瘤形成的潜在基础。因此，弄清楚这些交互作用的分子机制和对被HPV特异调节的基因的认识有助于宫颈癌诊断和新方法的进展，有助于从开始发病过程中分辨出真正的瘤形成。最近在众多可能替代的标志物中选出了以下几种：p16INK4a(cyclindependent kinaseinhibitor p16)、周期蛋白E(cyclin E)、端粒酶(telomerase)、Ki~67、PCNA(proliferatingcell nuclearantigen)和中心体数目(centrosome)，似乎最有可能成为对宫颈鳞状细胞的HPV感染检测的替代标志物。

　　1  p16INK4a

　　真核细胞的细胞周期的进程是被细胞因子依赖杀伤性间连续不断的相互作用和激活来调节的。CDKI(cyclin dependent kinase inhibitor)激活的调节是由它们翻译后修正(磷酸化作用／脱磷酸化作用)和细胞因子间的相互关系来测定。CDK的激活引导RB(retinoblastoma protein)的磷酸化作用，至少部分地控制从G1到S相的进程，E2F转录因子的活力被封闭。因为它们容易致瘤的特性，细胞因子的活力和有助杀伤，有必要小心地在多个水平上进行调节。CDK抑制蛋白，如p16INK4a，与CDK4和CDK6间特异的相互作用阻止了RB磷酸化和不断的E2F激活和细胞周期进程。因此，CDK抑制蛋白功能作为肿瘤抑制物和它们的灭活有助于癌症进展［1］。

　　高危型HPV持续感染的宫颈角化细胞p16INK4a蛋白过度表达，虽然它的细胞机制不完全清楚，但据证实HPV感染细胞内p16INK4a上调更可能导致E7调节RB的降解，将负调控p16INK4a的表达［2］。尽管它的异常表达，p16INK4a在这些细胞中不具备生物活性，因为功能性RB需要对p16INK4a显示出生长抑制效应［3］。困此，即使有高水平p16INK4a存在，HPV感染细胞仍能增殖和发生癌性转化。这些发现证实p16INK4a对检测活化的高危型HPV感染细胞是一种特异和灵敏的替代生化标志物。

　　Klaes［4］等在石蜡包埋组织中，在高危型HPV感染相关所有的宫颈间皮病变和60例浸润型宫颈癌的58例胞浆中，观察到对p16INK4a强的免疫结合。在低危型HPV阳性的正常宫颈上皮、炎性病变、低度宫颈病变中观察到非特异性结合。相似的结果被Keating［5］等报道，高危型HPV感染的宫颈上皮细胞显示的结果是强的弥漫的胞浆p16INK4a着色。在基底上皮有弥漫的但微弱的胞浆着色、在化生细胞内有局部着色、在萎缩上皮内未见着色。

　　虽然这些研究是在少数标本中进行的，但结果显示p16INK4a的检测可能作为一种替代标志物用于分辨增殖异常的宫颈上皮细胞。

　　2  Cyclin E

　　在Tae Kim［6］等的一个研究中，Cyclin E在23例CIN中有7.1%、在45例浸润型宫颈癌中有12．3%、而对照组中只有1．2%(22例)。在45例浸润型宫颈癌中，CyclinE的指数在鳞癌中有15．5%、腺癌中有4.6%、腺鳞癌中有9．2%。Keating［5］等报道CyclinE着色和HPV阳性间密切相关。61例HPV阳性病例中的51例，包括41例高危型HPV中的38例和20例低危型HPV中的13例CyclinE阳性。57例CyclinE阳性中的51例HPV也表现为阳性。这个结果显示CyclinE阳性与HPV阳性相关性的预期值和特异性分别是89．5%和84%。在33例LSIL中的75．7%，Cyclin E显示出浓厚的着色，而所有湿疣上皮着色限定在2／3以上，22例LSIL的77%上皮着色小于2／3。因为它的高度特异性，研究者认为CyclinE像p16INK4a一样有助于在正切部分或不好定向的伴或不伴非典型的上皮异常中检测HPV调节上皮损伤［3，7］。在本研究中，CyclinE阳性在液态宫颈拭子中的高度发育不良细胞中检测到。

　　Weaver［7］等研究了CyclinE在液态宫颈标本中作为一种检测HPV相关病变诊断标志物的应用。在所有20例HPV阳性标本中，在48例ASCUS的73%、21例正常宫颈标本的19%中检测到CyclinE。作出了Cyclin E表达与HPV感染型别间无相关性的结论。

　　3  端粒酶

　　端粒酶被发两位于染色体末端的重复的DNA序列，阻止染色体酶的降解，而最后导致的畸变、重组和融合。在细胞分化和基因稳定性方面，端粒酶可保证完成染色体复制。端粒酶序列随每一次DNA复制逐渐缩短至到一个临界的长度，细胞分裂完成，细胞进入衰老状态。端粒酶主要的功能是通过增加染色体末端六聚体TTAGGG重复来稳定端粒长度。TRAP是一种两步检测端粒酶的方法，用端粒酶将端粒重复加在随后的PCR扩增检测的底物寡核苷酸的末端。

　　HPV诱导角化细胞永生化与细胞端粒酶活性的增加密切相关，部分地由端粒酶催化的HPVE6调节控制［8，9］。

　　Jarboe［10］等用TRAP方法观察宫颈组织端粒酶活性，正常病例0%~18%、LSIL中0%~100%、HSIL中28%~96%、癌症病例中有86%~100%［10］。多个证据显示在HPV感染细胞中端粒酶表达的检测也可作为一种宫颈细胞病的诊断标志物。尽管研究间存在差异，这些结果仍显示出端粒酶活性随HPV感染妇女宫颈病变的进展增加。

　　宫颈标本中端粒酶表达可作为HPV相关病变的诊断标志物。它的实际应用，需要重复性好且灵敏的标准方法进展，能在常规临床实验室中容易完成。

　　4  Ki67

　　Ki67是一种非组蛋白，它的表达与哺乳动物细胞中细胞周期进展密切相关。因此，MIB1抗体，认为是Ki67抗原被广泛用作检测细胞增殖的一种标志物。Ki67在萎缩的宫颈上皮中缺乏［11］，提示Ki67可作为一种可靠的标志物，以对中年患者形态学复杂的宫颈标本从瘤样上皮改变中辨别出萎缩。Keafing［5］等报道19例LSIL中有18例、21例HSIL中有15例，包括2例未全形成湿疣显示出基底下Ki67着色，而29例转化病灶只在2例中观察到着色。在本研究中，24例高危型HPV鳞状上皮内病变有20例基底下Ki67着色。调查检测到HSIL比LSIL和正常上皮存在多比例浓厚的Ki67着色(P<0．001)。Zeng［12］等在49例真空干燥宫颈拭子中发现MIB1阳性(每个拭子有4个以上阳性细胞)与细胞学诊断，随后的阴道镜直接活检，宫颈刮片，细胞学随访相关。对异常者的随访发现有35例(71%)病例与MIB1阳性有关系；调查建议MIB1染色适合作为一种宫颈细胞学的候选工具检测异常细胞的改变。

　　因此，Ki67可作为一种潜在有用的生化标志物在宫颈活检中从癌前和癌症中辨别上皮病变的开始。

　　5  增殖细胞核抗原

　　增殖细胞核抗原(PCNA)是一种核蛋白，在细胞周期进程中起重要作用。在异常细胞中，PCNA着色水平随从癌前到浸润型癌病变的进展增加［13］。与正常鳞状上皮比较，只有基底下和基底细胞PCNA阳性，在湿疣积累和低度上皮内瘤样变的上面上皮层不同角化细胞PCNA表达增加。合成的诱导与高拷贝的HPVDNA存在相关，依赖于感染的HPV型别可能的致癌危险性［14］。虽然可作为一种有希望的生化标志物用于检测宫颈细胞中HPV感染，它的灵敏度和特异性需要进一步弄清。

　　6  中心体

　　基因不稳定性已作为恶性细胞分辨的特征被认识很长时间了。中心体异常引起缺损的有丝分裂极形成，导致染色体异常和基因不稳定性。Duensingr［１5，16］等检测了HPV E7蛋白诱导中心体异常，作为在瘤形进程中一个早期证据。在Skyldberg［17］等的一个研究中，用免疫荧光染色法分析了一种重要的中心体基质蛋白Y微管蛋白的位置，调查显示正常和湿疣堆积细胞有一个或2全中心体，而CIN病变每个细胞有较高的中心体数目，这种异常随病变分级进展增加，CINI级和浸润型宫颈癌分别有着最低和最高的中心体数目。

　　随着分子生物学技术的进一步和对宫颈病变与HPV关系的进一步研究，有望对HPV相关宫颈病变的详细机制、病程进展及预后预测方面选择出更合适、更灵敏和特异的HPV替代标志物。方法学上也可能进一步改进至可能准确定量和自动化。

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