第二代杂交捕获技术探讨
作者：尹有群，王晓文，赵继红
【摘要】 目的：探讨如何保证第二代杂交捕获(HC2)技术的质量。方法：我院5 684例宫颈黏液脱落细胞标本进行裂解—杂交—捕获—反应—冲洗—收集信号—判读。结果：RLU/Cutoff≥1为阳性，<1为阴性，阳性为人乳头状(HPV)病毒感染。结论：为保证实验结果的准确性，操作时要细心严谨注意避免交叉感染，室温要恒定20 ℃～25 ℃，孵化时间要准确60 min，冲洗所用的水与冲洗的质量要保证。
【关键词】 HPV?DNA；杂交捕获；探讨
大量资料已经证实了人乳头状瘤病毒(HPV)持续感染是子宫颈癌的主要病因，HPV?DNA检测作为宫颈癌的初筛手段可更灵敏地检出宫颈癌及其癌前病变，检测的方法有很多，其中第二代杂交捕获(HC2)是唯一经美国FDA认证的可快速准确地检测出13种高危型HPV病毒的检测技术，经证实其阴性预测值高，实验的重复性好［1］，但因其方法相对繁琐，操作过程中容易交叉污染而出现假阳性，现将对我院进行的5 684例实验的一些经验介绍如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 我院就诊的5 684例妇女的宫颈黏液脱落细胞。
1.2 设备 Digene公司的专用采样器、水浴箱、振荡器、加热器、Digene公司的DML 2000系统、试剂盒。
1.3 方法
1.3.1 裂解 (样品DNA双链补充释放并分解成为可以杂交的核苷酸单莲)加5滴指示剂于裂解液中混匀。加1 000 μl裂解液至阴性对照(NC)，换盖，混匀；加500 μl裂解液至阳性对照HHigh Risk Cal)，换盖，混匀；加500 μl裂解液至标本(妇科医生用专用采样器采集子宫颈脱落细胞)，换盖，混匀。放于65 ℃水浴箱裂解45 min，各管均呈紫色。换手套，配备HPV Probe B(1：25)。
1.3.2 杂交 (DNA单链与RNA组合探针结合为RNA?DNA复合体)分别吸25 μl已配好的探针B(Probe B)至96孔微孔板中各孔，再分别吸75 μl已裂解的质控(先阴性、阳性)和标本至各孔，混均，检查所有孔是否变成黄色，未变黄色的需要补加探针直至变成黄色，贴上胶纸放于加热器65 ℃孵化60 min，取出立刻撕掉胶纸，放置5 min冷却。
1.3.3 捕获 (第一抗体即特异性抗体与DNA?RNA杂交复合物固定在微孔壁上)将各孔液体(100 μl)转移至捕获孔，贴上胶纸，振荡(1 100+/?100 r/min)60 min，吸出液体弃掉，将孔板用力拍打于吸水纸上至干。
1.3.4 反应 (偶联有碱性磷酸酶的第二抗体与RNA杂合体结合)吸75 μl DR 1(Detection Reagent 1)至各孔，盖上胶纸，在20 ℃～25 ℃放置30 min，快速翻转倒掉液体，用力拍打至干。
1.3.5 冲洗 用双蒸水配制冲洗液， 冲洗6次(垂直冲至底部，要有一定冲力)，于吸水纸上用力拍打，并置于纸上5 min至干，换手套。
1.3.6 收集信号 (碱性磷酸酶使酶底物发光，判读光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA?DNA杂合体的含量)吸75 μl DR 2(Detection Reagent 2)至各孔，置暗处20 ℃～25 ℃ 15 min。
1.3.7 判读 在DML 2000系统上判读，分析演绎结果，打印报告。
2 结果
RLU/Cutoff≥1为阳性，<1为阴性，阳性为HPV感染。
3 讨论
HPV有100多种不同的亚型，大部分都没有致癌性，而且HPV感染后不一定会进展为高度病变，绝大部分会消退，而且妇女从感染HPV到发生宫颈癌一般需要5 a～10 a时间。研究表明只有高危型HPV持续感染才有患高度宫颈病变的风险，高危型HPV只有20种，最经典的只有13种，HC2是经美国FDA认证的可快速准确地检测出13种高危型HPV病毒。HPV?HC2检测因其采用标准试剂盒，在DML 2000系统上判读，分析演绎结果，人为主观因素影响小，是经ALTS(多中心随机实验)的临床认证评估，证实它的确是一个可信的，实验结果在不同实验室都可重复的实验，其阴性预测值高达99%以上［1］，即如果一个妇女HPV检测结果为阴性，那么她5年内患宫颈癌的概率<1%。目前很多临床医生和实验室工作人员对LSIL和ASCUS都感到束手无策，所以有很高阴性预测值的HPV检测正好给临床医生提供了一个更好的解决方案，从而预测出宫颈癌的患病风险。HC2试验的基本原理是在分子水平采用基因杂交—化学发光—信号放大的检测技术对HPV?DNA进行定量检测。检测结果的判断标准是RLU(相对光单位，光信号)/Cutoff(域值=三个阳性质控指标的平均值)≥1为阳性，<1为阴性；实验设三个阴性和三个阳性质控指标。阴性质控指标(NC)：有效数值10 RLU～250 RLU，差异系数≤25%，如果>25%，那么,弃去离得最远的RLU值，剩下的RLU值的CV值，如果CV值≤25%则有效，否则就无效；阳性对照(HRC)：CV≤15%for 3HRCs，如果>15%，那么弃去离得最远的RLU值，计算剩下的RLU值的CV值，如果CV≤15%则有效，否则就无效；HRC/NC比值：2≤HRC平均值/NC平均值≤15，如果比值<2.0或>15，测定无效，必须重新进行检测。依据上述的标准，一旦测定被判定为有效，用于判定阳性标本的临界值为校准品的RLU值的平均值。为阴性的标本，表示未检出13种高危型HPV?DNA序列或标本中其浓度水平在测定方法的检测限度以下，如果一个标本的RLU/CUTOFF比接近但<1.0且被怀疑有高危型HPV感染，应该重新采集标本。HC2实验结果的判断人为主观因素影响小，但因其操作繁琐，容易受个人操作因素的影响，因此在操作时需注意：实验室温度要求保持在20 ℃～25 ℃；从冰箱拿出的试剂均要在振荡器上稍振荡以混匀；一个新的试剂盒开始使用时，质控会被第一次裂解，经裂解后的质控，在下一次检测时不必再次裂解；此HPV检测试剂盒可分批使用，但建议不要超过5次，最好不要超过5次，以免多次使用造成污染；使用移液枪时，注意在取液时不要碰到容器口或壁，否则应换枪头，每次检测时均要加入质控指标，按微孔板位置第一列前1孔～3孔固定为阴性质控孔，4孔～6孔固定为阳性质控孔；加裂解液至各管时，注意加入的裂解液的量要相同；配HPV探针时要先换手套，以免污染探针，探针的量要准确，以使每个标本的反应条件近似相同；封口胶纸要贴紧、平，以防振荡和孵化时发生孔与孔的交叉污染；孵化时间要准确60 min，孵化过程中不要振动孵化器，从孵化器中拿出后要立刻撕掉胶纸，以防蒸汽倒流出现交叉污染；并另外盖上胶纸等待冷却，以防蒸发过多；在加样进微孔板时要注意枪头应进入约1/3的孔的深度，枪头倾斜一定角度 (45°，60°)以免液体溅出污染，在一个阳性值较高的孔的周边出现星形分布的一些低值的阳性孔时可疑为交叉污染，必要时取材重做。转移时务必尽量将每个孔的液体吸净；在吸出液体时，注意不要用力刮捕获孔壁，以防将有用物质从孔壁刮除；冲洗所用的水与冲洗的质量决定着检测结果的成功与否，因此冲洗时要有一定的冲力，垂直冲至孔底，并可看到从孔壁处返流上来的水柱，冲洗所用的水必须是双蒸水；冲洗完毕把微孔板拍打干时要尽量拍干，冲洗后需要更换手套，以免污染DR 2；加DR 1和 DR 2时按使用量各倒出一部分在干净的试管中，以免污染整瓶试剂。加DR 2后，一定要将微孔板立即放入黑暗处。判读完毕后要尽快把微孔板拿出，以免损坏探头。我们通过不断的实验操作，本实验室的可疑结果减少，实验重复性好，结果的可信度提高。
【】
［1］ Karen Titus Making a valid point about HPV tests.CAP TODAY［J］.2005:9.
