荧光定量Taqman技术在检测乙肝病毒DNA中的应用

【摘要】  目的：探讨荧光定量Taqman技术检测乙肝病毒（HBV）感染者乙肝病毒脱氧核糖核苷酸（HBV?DNA）的临床意义，以及与乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝e抗原（HBeAg）的相关性。方法：采用荧光定量Taqman技术对76例乙肝感染者HBV?DNA的检测。结果：在76例标本中，HBV?DNA的阳性率为42.1%，HBsAg的阳性率为75.0%，HBeAg的阳性率为17.1%。结论：HBsAg、HBeAg反映HBV的复制状态存在局限性，HBV?DNA定量检测是反映HBV复制和药物疗效的判断最直接可靠的指标。

【关键词】  乙肝病毒；荧光定量Taqman技术；应用

　　荧光定量Taqman技术是一种新的基因定量检测技术，该技术实现了核酸扩增(PCR)从定性到定量的飞跃，融会了PCR的高灵敏性，DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点，有效地解决了其他方法很难处理的PCR污染的问题，尤其在检测乙肝病毒DNA（HBV?DNA）中的应用越来越受重视［1］。本文结合血清学指标乙肝两对半，初步探讨荧光定量Taqman技术在检测HBV?DNA中的临床价值。

　　1  材料与方法

　　1.1  标本  乙型肝炎血清标本来自本院住院和门诊患者；正常血清标本来自本院输血科。用一次性试管收集血液，分离血清，置-40℃保存或立即检测。

　　1.2  荧光定量Taqman技术检测

　　1.2.1  仪器与试剂  仪器采用德国Roche Diagnostics GmbH公司的LightCycle PCR扩增仪。试剂采用上海克隆生物高技术有限公司乙型肝炎病毒（HBV）PCR荧光定量检测试剂盒。

　　1.2.2  技术原理  荧光定量PCR法采用了先进的Taqman 荧光探针技术，其试剂比常规PCR试剂多了一个寡聚核苷酸探针，这个探针带有一个荧光发光分子和一个荧光淬灭分子，完整的探针在激光下，发光分子所产生的荧光被淬灭分子全部吸收，样品无荧光，而PCR扩增中，Taq酶在链延长过程中，可通过自身的5'?3'核酸外切酶活性降解与模板结合的特异性荧光探针，使荧光发光分子与淬灭分子分开，从而在激光下产生特定波长的荧光，这种荧光随着PCR扩增过程呈动态增强，可以检测到一个荧光增长曲线，通过测定荧光强度可进行起始模板的定量分析［2~4］。

　　1.3  标本、对照品的处理  血清标本，试剂盒阳性、阴性对照各取100 μl（冻存血清或对照品使用前在室温融解，振荡混匀10 s），分别加入100 μl核酸提取液A，振荡混匀10 s，13 000 r/min离心10 min，弃上清；分别加入25 μl核酸提取液B至沉淀中（核酸提取液B使用时一定要充分混匀，边振荡边将颗粒和液体一起加入沉淀中，其中颗粒量应在15%以内），振荡混匀10 s，100℃沸水浴10 min，13 000 r/min离心2 min。处理后的样品应在1 h内使用，或在-20℃~-80℃最长保存1个月（不宜反复冻融）。

　　1.4  试剂准备、加样和PCR扩增

　　1.4.1  试剂准备  按样品数n取HBV PCR缓冲液n×18 μl、MgCl2 n×3 μl、HBV荧光探针n×3 μl、Taq酶n×2 μl混于一离心管中，旋涡振荡器上振荡混匀10 s，低速离心数秒，按每管26 μl分装。

　　1.4.2  加样  将样品处理上清液（冻存样品使用前室温充分融化，振荡混匀数秒，13 000 r/min离心2 min）和定量校准品（使用前应先离心，再充分振荡混匀）1号~4号各4 μl分别加入反应管中，混匀后分别取20 μl移入专用毛细管中，低速离心数秒后置入Light Cycle，立即进行PCR扩增反应。

　　1.4.3  PCR扩增  反应管先在50℃反应1 min，然后94℃保温2 min，再按93℃ 3 s~60℃ 30 s循环40次。

　　2  结果

　　2.1  乙肝两对半和荧光定量Taqman技术检测结果比较  乙肝两对半检测的HBsAg的阳性率显著高于HBeAg和荧光定量Taqman技术检测HBV?DNA的阳性率（HBV?DNA含量>4.2×102 copy/ml），而HBV?DNA的阳性率要高于HBeAg的阳性率，见表1。

　　表1  HBV?DNA、HBsAg、HBeAg的阳性率的比较（略）

　　2.2  乙肝两对半检测的HBsAg与 HBeAg及荧光定量Taqman技术检测HBV?DNA的比较  HBsAg为阳性的患者的HBV?DNA和HBeAg可能为阳性，也有可能为阴性,其中HBV?DNA阳性率为52.6%（30/57），HBeAg阳性率为22.8%（13/57）；HBsAg为阴性的患者其HBV?DNA和HBeAg一般都为阴性，但也有少数例外，检测中有2例HBsAg和HBeAg都为阴性而HBV?DNA却为阳性。

　　2.3  乙肝两对半检测的HBeAg与 HBsAg及荧光定量Taqman技术检测HBV?DNA的比较  HBeAg为阳性的患者的HBV?DNA和HBsAg一般都为阳性；HBeAg为阴性的患者其HBV?DNA和HBsAg可能为阳性，也可能为阴性，其中HBV?DNA阳性率为31.7%（20/63），HBsAg阳性率为69.8%（44/63）。

　　2.4  荧光定量Taqman技术检测HBV?DNA与乙肝两对半检测的HBeAg及HBsAg 的比较  HBV?DNA为阳性的患者的HBsAg一般都为阳性，而HBeAg可能为阳性也可能为阴性，其阳性率为37.5%（12/32）；HBV?DNA为阴性的患者的HBeAg一般为阴性，HBsAg可能为阳性，也可能为阴性，其阳性率为59.1%（26/44）。

　　3  讨论

　　近年来采用Taqman技术对HBV?DNA的实时定量检测越来越受到重视，而血清中HBV?DNA的水平是判断乙肝病毒在体内是否复制、传染性高低以及选择方案和观察治疗疗效的重要指标［5，6］。HBsAg乙肝表面抗原，一般在患者感染乙肝后29 d~43 d（或18 d~24 d）出现阳性。检测结果表明血清中的HBV?DNA反应比HBsAg反应灵敏，检测中有2例HBsAg和HBeAg都为阴性而HBV?DNA却为阳性，由于乙肝部分感染者的HBsAg可自动转阴，但有人终身携带而无活动病变存在，所以乙肝感染者可以通过HBV?DNA的测定来判断是否有感染病毒，也可作为转归、愈后的指标，HBsAg的变化滞后于HBV?DNA含量的变化。HBeAg是乙肝传染性较强指标之一。检测结果显示HBeAg是血清学标志反映HBV?DNA的重要指标，HBeAg阳性表示HBV复制活跃（拷贝数可>105 copy/ml），HBeAg转阴后，HBV复制减弱。综上，荧光定量Taqman技术测定HBV?DNA，自动化程度高、省时、可免除PCR的后处理、减少PCR产物的污染，其优点在于判断病原体的复制情况及病程、患者及标本传染性的强弱、抗病毒治疗的疗效观察、提高早期诊断率、增强输血安全性和计划免疫的方面起到了重要作用［7］。由于乙肝两对半的反应相对滞后，灵敏度差，荧光定量Taqman技术检测HBV?DNA已成为反映HBV复制和药物疗效的判断最直接可靠的指标，但乙肝两对半检测也存在自身的优点，故不能用荧光定量Taqman技术完全取代乙肝两对半检测。

【】
  　［1］ 赖宏芬，荧光探针定量PCR检测HBV?DNA［J］.上海医学检验杂志，2000，15（1）：18.

　　［2］ Liva KJ, Flood SJA, Marmaro J, et al. Oligonucletides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization［J］. PCR Methods Applic,1995,4:357?362.

　　［3］ Holland PM, Abramson RD, Waston R, et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'?3' exonuclease activity of the themus aquaticus DNA polymerase［J］. Proc Nat Aca Sci USA,1991,88:7276?7280.

　　［4］ Higuchi R, Dollinger G,Walsh PS, et al. Stimutaneous amplification and detection of specific DNA sequences［J］. Biotechnology,1992,10:413?417.

　　［5］ Rokuhara A,Tanaka E,Matsumoto A，et al. Clinical evaluation of a new enzyme immunoassay for hepatitis B virus core?related antigen ；a marker distinct from viral DNA for minitoring lamivudine treatment［J］. J Viral Hepat,2003,10(4):324.

　　［6］ Ho SK ,Yam WC,Leung, et al. Rapid quantification of hepatitis B virus DNA by real?time PCR using fluorescent hybridization probes［J］. J Med Microbiol,2003,52(5):397.

　　［7］ 刘晓峰.光探针定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA的临床应用［J］. 中西医结合杂志，2005，14（5）：648?649.