DNA甲基化在乳腺癌早期诊断治疗中的价值

【关键词】  乳腺癌；诊断；

　　近年来，乳腺癌已经成为女性恶性肿瘤发病率的首位，早发现、早诊断、早治疗具有重要的意义。肿瘤相关基因启动子甲基化状态的改变在人类肿瘤发生的分子机制中占有重要地位，多项研究表明，DNA甲基化对乳腺癌发生和转移相关基因的调控起重要作用。目前，通过检测患者特定基因甲基化状态做到早期诊断乳腺癌以及运用甲基化抑制剂来治疗乳腺癌已成为国内外学者研究的热点。

　　1  DNA甲基化与肿瘤

　　长期以来，肿瘤发生机制一直围绕基因突变、缺失导致DNA序列改变从而使癌基因激活，抑癌基因失活进行的，近年的研究表明，一些肿瘤的重要基因并没发生缺失或突变的异常，而只是存在基因表达的异常，从而提出了渐成说机制。它是哺乳类动物遗传外修饰的主要机制：主要通过DNA甲基化实现的，这种改变具有可逆性，遗传性。DNA甲基化是一种在甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）作用下的共价化学修饰，是在胞嘧啶环的C?5上增加甲基的过程。在脊椎动物基因组中，DNA甲基化发生于CPG二核苷酸的胞嘧啶残基上，不同于遗传改变，这种后天变异虽然是可遗传的但并不改变核苷酸序列，且可能逆转。哺乳动物约3%~6%的胞嘧啶是甲基化的, 而约70%~80％人类基因组的CPG是甲基化的。这种DNA甲基化可以在转录水平调控基因表达，通过基因启动子及附近区域内CPG岛胞嘧啶的甲基化可以关闭某种组织活细胞不必要的基因，而去甲基化作用则可指导组织特异性活阶段特异性基因的活化。在正常组织中，广泛表达的基因启动子区CPG岛常处于非甲基化状态，肿瘤细胞中，这些CPG岛常变为甲基化状态，其相关基因的表达即被关闭。甲基化导致转录失活的部分机制已被阐明,主要包括以下几种:甲基化直接干扰序列特异的转录因子（如AP?2、E2F和NFκB）与DNA的结合;甲基化的CPG序列能恢复转录协同抑制因子（如mSin3A、DMAP1、TSG101或Mi2）的抑制转录功能；通过与组蛋白乙酰转移酶（HDAC）家族成员作用改变染色质结构而使一系列甲基化组织特异性基因和印迹基因失活影响转录。

　　2  乳腺癌相关基因的甲基化及意义

　　大量的证据表明CPG岛的高甲基化与乳腺癌的一系列关键基因的表达缺失有关。BRCA1基因是乳腺癌和卵巢癌特异性抑癌基因。高表达于正常乳腺、卵巢组织，而在乳腺癌和卵巢癌组织中表达常常缺失或下调。目前的研究认为，在约50％的遗传性乳腺癌中，BRCA1基因的可遗传性突变是主要的分子机制。但在散发性乳腺癌中却很少检测到BRCA1基因突变和杂合性缺失。Catteau等应用southern印迹分析散发性乳腺癌中BRCA1基因启动子甲基化情况，11％的病例的BRCA1启动子高甲基化。国内冯景等运用甲基化特异PCR方法分析93例散发性乳腺癌。结果显示29％的BRCA1基因启动子异常甲基化。可见，在散发性乳腺癌中，甲基化状态的改变是BRCA1基因失表达的重要机制之一。P16是人类肿瘤中最常见的抑癌基因，是细胞周期蛋白激酶抑制剂。其基因表达产物p16蛋白能与周期蛋白竞争结合细胞周期素依赖激酶(CDK4、6)，从而抑制细胞周期素D与CDK复合物的活性，阻止细胞进入G1/S期，抑制细胞的分裂与增殖。目前对乳腺癌组织中p16基因变异及表达情况国内外学者报道不一，一般认为在良性乳腺病变中没有p16基因的变异，而在乳腺癌患者组织中约一半的p16基因呈现甲基化改变，分期越晚，淋巴结转移越多的患者，p16基因缺失和突变率就越高。提示p16基因的甲基化不仅参与乳腺癌的发生，而且参与乳腺癌的进展和转移。ER是生长调节基因，其表达失活会引起细胞一系列生物学改变。乳腺癌中ER失表达是经常性的事件。但常见的基因失表达的原因如等位基因的纯合性缺失、突变等意义不大。有关的研究认为，ER基因的甲基化异常是其失活的主要机制。在正常乳腺组织及ER阳性乳腺癌细胞系中未发现ER基因cpg岛甲基化，相反的情况却出现在ER阴性乳腺癌细胞系及原发乳腺癌组织中。上皮钙黏附蛋白（E－cadherin）是一种重要的钙依赖性黏附分子。在原发乳腺癌合乳腺癌细胞系中可发现钙粘蛋白基因甲基化，引入钙粘蛋白能明显降低乳腺癌细胞生长能力，使其向正常形态转变。在钙粘蛋白表达阴性的乳腺癌细胞系合乳腺原发肿瘤中，该基因CPG岛甲基化程度高，而在正常乳腺组织中没有发现甲基化情况。

　　3  DNA甲基化在乳腺癌早期诊断中的应用

　　CPG岛在正常成人组织中一般是非甲基化的，而在大部分肿瘤组织中表达为基因组低甲基化，一些关键的肿瘤抑制子和生长调节基因上的部分启动子高甲基化。CPG岛的局部高甲基化的出现往往早于细胞的恶性增生，因此一种选择性以DNA为基础的早期检测对于预测肿瘤的发生可能很有前途。Wlee等的研究证实GSTP1基因甲基化在前列腺癌患者中有高表达（100％），而在正常前列腺组织及良性前列腺疾病中没有发现。SusanVHarden等在对肺癌的研究中发现有多种基因的高甲基化，且与肿瘤预后有关，Esteller甚至认为其对小细胞肺癌发病前的早期诊断敏感性可以达到100％。正确的诊断能为治疗提供明确的方向，应用于临床的乳腺疾病诊断方法很多，如影像学、细胞学、组织学、免疫组化等，这些方法效果很好，但存在一个明显的缺陷。它们只能在发现恶性征象如肿块后才能判断肿块是否有癌变。而甲基化状态的改变通常出现在恶性病变前，高甲基化是肿瘤发生的早期事件，能导致细胞易于向恶性转化，癌前病变通常显示有异常的甲基化。因此，利用检测血液、乳腺导管分泌液或冲洗液中特异基因的甲基化状态为乳腺癌的早期诊断、治疗及预后的研究提供了新的思路。与乳腺癌中其他DNA变异相比启动子CPG岛高甲基化检测更有优势，即使是在大量非甲基化DNA存在的情况下，甲基化DNA也能被检测到并有高度特异性。例如，在10 000个非甲基化的等位基因中单个高甲基化也能通过methylight技术检测到。已经可以从乳腺癌患者的血液及导管冲洗液中检测到甲基化的DNA。在患者的血液中检测甲基化的DNA也已被证实可用于初步诊断或在疾病复发的早期检测中作为预测指标。在Matsubayashi等的研究中表明对胰腺进行定量甲基化分析能精确区分胰腺癌和其他胰腺疾病。收集乳头分泌液进行甲基化检测已证实可用于癌症早期检测甚至是非侵入性或恶变前损害。需要进一步探讨的问题是：应该分析哪些基因，应该应用何种技术以发现在乳腺癌癌前病变以及肿瘤进展中基因甲基化变化情况，从而找到对乳腺癌做出精确早期诊断的甲基化基因。

　　4  DNA甲基化在乳腺癌内分泌中的应用

　　临床工作中，我们都知道ER的出现是对乳腺癌进行内分泌治疗的依据。大约有2/3的乳腺癌患者ER表达水平比正常人高，这类患者一般内分泌治疗有效，疾病缓解期长，但还有相对一部分患者乳腺癌组织中没有ER的表达，这些患者一般预后不良，内分泌治疗亦不敏感，特别值得注意的是，起初ER阳性的乳腺癌患者在内分泌治疗中会有约1/3转为阴性。因此，探讨乳腺癌患者ER表达失活机制对提高内分泌治疗的疗效具有重要意义。ER基因CPG岛甲基化可能是ER表达丢失的机制之一，那么去甲基化可能恢复ER基因的再表达。对乳腺癌患者来说，可再次获得内分泌治疗的机会，无疑可改善这部分患者的预后，提高她们的生存质量。所以，干预逆转DNA甲基化可作为一种治疗肿瘤的方向。目前国内外都正在应用DNMT和HDAC的抑制剂作这方面的研究尝试。实际上，DNMT的抑制剂临床上早已在白血病、脊髓发育不良征等疾病中应用，但在乳腺癌治疗中还处于试验阶段。经典的甲基化抑制剂5?氮杂胞苷（5?aza?c）和5?氮杂脱氧胞苷（5?aza?dc）是胞嘧啶的类似物，它们参与形成的DNA与DNMT形成共价化合物抑制DNMT的活性，从而逆转被甲基化的基因。此外，还了更特异的DNMT基因反义寡核苷酸，可直接导致DNMT的失活。目前，一期临床试验已经表明，ER阴性乳腺癌细胞株对5?aza?dc更敏感，其程度与DNMT水平呈正相关。Bovenzi等应用MS?PCR法检测5?aza?dc体外乳腺癌细胞株MDA?MB?231中的抗癌活性，也同样显示了良好的抗癌作用。此外，HDAC的抑制剂如phenybutyrate已经FDA许可进入临床使用，但是这方面的研究也只是刚刚起步，用于治疗乳腺癌尚待时日，许多问题诸如5?aza?Dc的毒副作用、药物的远期效益等还有待阐明。

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