水溶性壳聚糖和壳寡糖的吸湿保湿性能及对几种致病菌抑制作用的研究
【摘要】 研究了水溶性壳聚糖、壳寡糖的吸湿性、保湿性能和其对铜绿假单胞菌、粪肠菌和肺炎克伯菌的抑菌作用。
【关键词】 水溶性壳聚糖；壳寡糖；吸湿性；保湿性；抑菌作用
生物活性多糖作为功效性化妆品添加剂在化妆品中的应用，是生物美容的一个重要方向。壳聚糖(Chitosan)作为一种界贮量丰富的天然活性多糖，是甲壳素（Chitin）脱乙酰后的产物,其分子内同时存在游离的氨基和羟基,具有特殊的生理活性,尤其是在抗菌抑菌方面。然而壳聚糖是一高分子化合物,分子量通常在几十万至上百万,且分子结构紧密,因而不能溶于水等普通溶剂,难以被吸收利用,限制了其应用［1］。同壳聚糖大分子相比,壳寡糖具有:较好的水溶性;吸湿保湿性;抗菌、抑菌功能。将壳寡糖和水溶性壳聚糖应用于化妆品中，不仅能产生保湿、稳定改善肤色、抗衰老和抗菌等功效外，还能祛除皮肤中过剩的重金属离子。因此，壳寡糖和水溶性壳聚糖作为功效型化妆品添加剂有着广阔的前景。本文就水溶性壳聚糖和三种不同分子量壳寡糖的吸湿、保湿性能及其对三种致病性菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、粪肠菌（Enterococcus faecalis）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia ）的抑制作用做了研究, 以期为壳聚糖在化妆品领域的应用提供依据，目前该方面的报道还未见到。
1 实验仪器和材料
1.1 实验仪器
LDZX 40ＣＩ型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅(上海中安医疗器械厂);DHG 9070Ａ型电热恒温干燥箱(上海益恒实验仪器有限公司);生化培养箱(国华电器);SNCJ 1BU无菌操作台(苏净集团安泰公司)；DENSIMAT型细菌电比浊仪（法国生物梅里埃公司）。
1.2 实验材料
1.2.1 水溶性壳聚糖
（自制，DD.85.3%、粒度100目、粘度30 Mpa.s）；壳寡糖(分子量3000,5000,10000,DD.>95 %,自制［2］)。
1.2.2 供试菌种
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、粪肠菌（Enterococcus faecalis）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia ）均为标准菌株。
1.2.3 琼脂蛋白胨固体培养基［3］（pH 7.3）。
2 实验方法
2.1 吸湿性和保湿性测定
室温下,将壳寡糖样品在干燥器中用五氧化二磷真空干燥12 h。吸湿性试验直接用该干燥样品。而保湿性试验则在干燥样品中加入其质量10 %的去离子水。
2.1.1 吸湿性测定
精确称取0.5 g样品两份,分别加入直径3 cm的称量瓶中,将称量瓶分别放置在两个干燥器中,一个干燥器内放有硫酸铵饱和溶液(相对湿度RH=81 %),另一个干燥器内放有饱和碳酸钠溶液(RH=43 %),放置时间为12 h、24 h、48 h,分别称量样品放置前质量(Wo)和放置后质量(Wn)根据下式吸湿率：吸湿率/%=100(Wn-Wo) Wo2.1.2 保湿性测定 室温下,精确称取0.5 g样品两份,分别加入直径3 cm的称量瓶中,加入质量分数为样品量10 %的水。一个称量瓶放置在预先装有饱和碳酸钠溶液(RH=43 %)的干燥器内,另一个放入装有干硅胶的干燥器内。放置时间为12 h、24 h、48 h,分别称量样品放置后水份量Hn和添加水份量Ho。根据下式计算水份残存率:水粉残存率/%=100 Hn Ho
2.2 体外抑菌实验
2.2.1 壳聚糖溶液的配制
以1 %HAc为溶剂，配制浓度为1.2 %、1.0 %、0.8 %、0.6 %、0.4 %、0.2 %的水溶性壳聚糖及壳寡糖溶液，置于4℃冰箱中待用。
2.2.2 菌种的活化
受试菌种接种于固体培养基内,在37℃ 活化24 ｈ。
2.2.3 菌悬液的制备
将活化后的受试菌种用接种环挑取菌苔于生理盐水中，稀释成含菌数浊度约为0.5 Mcf左右的菌悬液备用。
2.2.4 抑菌测试方法（琼脂扩散纸片法）
将直径为6 mm的圆形滤纸片放入各不同浓度的水溶性壳聚糖和壳寡糖溶液中一同高压蒸汽灭菌（120℃、0.12 MPa）20 min。取各种菌悬液100 μl均匀涂抹在培养基平皿表面，用无菌镊子将各滤纸片贴在各种含菌平皿上，每皿贴7个，分别对应于浓度及对照(中间)。本实验壳聚糖浓度设置分别为1.2 %、1.0 %、0.8 %、0.6 %、0.4 %、0.2 %。并以1 %的醋酸为对照, 对照样除不加壳聚糖外,其他条件与加有壳聚糖的培养基一致。每种菌种重复3次试验,在37℃下培养24 h,测定圆滤纸片的抑菌圈直径。如果抑菌剂能杀死或抑制皿中供试菌的生长,则在滤纸片的周围会出现一个无菌生长的透明圈,即抑菌圈。以抑菌圈的直径作为评定指标,抑菌圈直径越大,说明该抑菌剂对此种供试菌的抑制效果越好,反之则抑制效果越差。抑菌圈数据见表1～表3所示。表1 水溶性壳聚糖、壳寡糖对铜绿假单胞菌的抑菌圈（略）表2 水溶性壳聚糖、壳寡糖对粪肠菌的抑菌圈（略）表3 水溶性壳聚糖、壳寡糖对肺炎克雷伯菌的抑菌圈（略）
2.2.5 最低抑菌浓度(MIC)的测定
取15 ml融化的琼脂培养基，加入等量不同分子量的壳聚糖1%HAc溶液,使每个试管壳聚糖含量分别为0.10 %、0.15 %、0.20 %、0.25 %、0.30%、0.35%和0.40%，灭菌，冷却后加入100 μl约0.5 Mcf的各被试菌菌悬液,涂布均匀后于37℃培养24 h,观察菌落生长情况,以不长菌的壳聚糖最低浓度为壳聚糖对各供试菌的最低抑制浓度。
3 结果与讨论
3.1 水溶性壳聚糖和壳寡糖的吸湿性和保湿性
图1、图2为水溶性壳聚糖和壳寡糖的吸湿性和保湿性能随时间的变化曲线。由图可以看出，水溶性壳聚糖和壳寡糖都有一定的吸湿、保湿性能，但存在差异。水溶性壳聚糖的吸湿性、保湿性能强与壳寡糖；随着壳寡糖分子量的降低，其吸湿、保湿性能增强。这可能是因为壳聚糖降解后得到的水溶性壳聚糖和壳寡糖其晶体结构受到了破坏，分子状态趋于松散，一些可与水分子亲合的极性基团如-OH、-NH2完全暴露和解离，更易与水分子形成氢键而结合大量水粉。同时，由于大量的氢键相互作用，使得壳聚糖分子链相互交织成网状，加之与水的氢键结合，起到很好的保水作用。相对于壳寡糖，水溶性壳聚糖的结构受到的破坏程度更大，分子间和分子内氢键的数量多，故其吸湿、保湿性能要优于壳寡糖，其吸湿性和保湿性能稍逊于甘油。
3.2 水溶性壳聚糖和壳寡糖的抑菌实验结果
表1~表3为水溶性壳聚糖和壳寡糖的体外抑菌实验结果。结果表明，无论是水溶性壳聚糖还是壳寡糖都对以上被试菌具有抑制作用。水溶性壳聚糖对铜绿假单胞的抑制作用较其他两种强。对于铜绿假单胞，分子量为5 000的壳寡糖对其抑制作用较为明显。而对粪肠菌和肺炎克雷伯菌，分子量为10 000的壳寡糖其抑制效果较好。图3为水溶性壳聚糖、壳寡糖对各被试菌的最小抑菌浓度，从中可以看出其抑菌性能之间的差异。这可能与不同细菌的特性及组成有关。我们应用透射电镜研究了经壳聚糖作用前后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的超微结构变化，发现作用后的细菌细胞明显变形，细胞壁及外膜出现破损，并有胞内物质的泄露，并通过生化分析仪得到了验证。说明壳聚糖对细菌的抑制作用主要是通过影响细菌细胞壁/膜的功能实现的，其破坏是不可逆转的。水溶性壳聚糖和壳寡糖分子量更小,易于透过细菌胞膜进入细胞质和细胞核内,使其细胞内部起生物活性的相关酶发生泄露，同时与带负电荷的物质如DNA相互作用,干扰DNA的复制与转录,从而发挥其抗微生物活性。水溶性壳聚糖和壳寡糖主要进入细胞内发挥作用,而壳聚糖在细胞外发挥作用。所以当壳寡糖进入细菌胞膜后,推测可能有一部分被细胞质内的酶降解或细菌利用,使其抗菌浓度和抗菌活性降低,使得壳寡糖较壳聚糖抗菌活性略低。但如果壳寡糖的分子量小到一定范围时，其不仅对细菌没有抑制作用，相反还有促进作用，这也与我们以前的研究结论相一致，也与［2，3］的结论一致。
4 结论
水溶性壳聚糖和壳寡糖都有一定的吸湿、保湿性能，但存在差异。水溶性壳聚糖的吸湿性、保湿性能强与壳寡糖；随着壳寡糖分子量的降低，其吸湿、保湿性能增强，其吸湿、保湿性能与其氢键有关。水溶性壳聚糖和壳寡糖对铜绿假单胞菌、粪肠菌和肺炎克伯菌都有一定的的抑制作用，其抑菌作用强弱与分子量和浓度有关。
【文献】
［1］Feng Xiao?qiang，Yang Sheng，Su Zhong?xing，et al. Study on the Preparation of Water?Soluble Chitosans by H2O2?HAc and Characterization［*］. Journal of Cellulose Science and Technology.2006，4.
［2］Hadwiger L A,Beckman J M. Chitosan as a component of Pea-Fusariumsolani interaction［J］. Plant Physiol, 1980,66:205?211.
［3］Benhamou N, Klopper J W,Tuzun S. Induction of resistance against Fusariumwilt of tomato by combition of chitosan with an endophytic bacterial strain: ultra structure and cytochemistry of the host response［J］.Planta, 1998,204:153?168.
