更年期大鼠Th1/Th2平衡与脾细胞凋亡

                作者：蒋竞，张绍芬，邹世恩，夏贤，陈王旬，刘瑞梓

【关键词】  更年期

    摘要：目的  了解更年期大鼠脾细胞凋亡与辅助性T细胞1(Thelper l, Th1)和辅助性T细胞2(Thelper 2, Th2)型细胞因子的增龄性改变。方法  应用Annexin VFITC/PI双染色流式细胞仪测定脾细胞凋亡率； ELISA法测血清γ干扰素(interferonγ, IFNγ)、白介素4(interleukin4, IL4)水平。结果  更年期组大鼠脾细胞凋亡率(10.3% vs. 7.7%, P<0.05)、血清IFNγ质量浓度明显高于年轻组大鼠(23.80ng/L vs. 10.92ng/L，P<0.01)；更年期组大鼠与年轻组相比血清IL4质量浓度有下降趋势，但差别无显著意义(0.1296ng/L vs. 0.3094ng/L, P>0.05)；更年期组血清IFNγ/IL4比值明显高于年轻组(183.64 vs. 35.29，P<0.01)，Th1/Th2平衡朝Th1漂移。结论  大鼠衰老过程中Th1/Th2平衡朝Th1漂移，脾细胞凋亡增加与IFNγ水平增高有关。
 
　　关键词：更年期；脾细胞；凋亡；Th1；Th2

　　The changes of Th1/Th2 balance and apoptosis in splenocyte of menopausal rats

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the relation between the apoptosis in splenocyte and the changes of Th1/Th2 balance in serum of menopausal rats. Methods  Twenty female SD rats were divided into two groups: menopausal group(n=10;15 months), young group (n=10; 5.5 months). The apoptosis in splenocyte of rats was measured by Annexin VFITC/PI flow cytometric assay. The levels of IFNγ and IL4 in serum were measured by ELISA. Results  The percentages of apoptosis cells in splenocyte of menopausal rats were significantly higher than that of young rats. The serum IFNγ level of menopausal rats was significantly higher than that of young rats(23.80ng/L vs. 10.92ng/L, P<0.01). The level of IL4 was similar in menopausal and young groups. Conclusion  The increasing of apoptosis in splenocyte of menopausal rats is related to the increasing of IFNγ levels with aging.

　　KEY WORDS: menopause; splenocyte; apoptosis; Th1; Th2

　　人体免疫功能随增龄而衰退是衰老过程中的一个关键因素，以致对感染及某些自身免疫性疾病易感。资料显示衰老时免疫功能的变化与免疫细胞凋亡密切相关[1]。近年研究发现[2]，老年人外周血CD+4T细胞产生γ干扰素(cinterferon γ, IFNγ)高于年轻组，而产生白介素4(interleukin4, IL4)降低，提示老年个体存在Th1极化现象。目前有关细胞因子变化与免疫细胞凋亡之间关系的研究较少。有研究表明活化诱导的淋巴细胞凋亡(activationinduced cell death, AICD)在免疫应答的负调节中发挥重要作用，而细胞因子能影响AICD[3]。我们通过检测脾细胞凋亡率，测定血清IFNγ、IL4和IFNγ/IL4比值，来探讨更年期大鼠脾细胞凋亡的变化及Th1、Th2型细胞因子的改变，为深入研究更年期随年龄增长而发生的免疫功能变化提供实验依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物  采用清洁级SD雌性大鼠(由本校上海医学院实验动物部提供，按清洁级饲养，自由饮水，标准颗粒饲料喂养，合格证号：scsk 沪动0033号)共20只，以月龄分为两组，更年期组10只(15月龄)，体质量(488.38±82.10)g；年轻组10只(5.5月龄)，体质量(282.76±9.67)g。两组大鼠饲养环境相同。

　　1.2  血清IFNγ和IL4测定  颈动脉插管采血，留血清，ELISA法测血清IFNγ、IL4质量浓度。

　　1.3  脾细胞悬液制备及培养  无菌取脾脏，研磨，TrisNH4Cl溶解红细胞，PBS洗涤，用于脾细胞培养。将脾细胞置37℃、5%(体积分数)CO2培养24h后，流式细胞仪进行凋亡率测定。

　　1.4  Annexin VFITC、PI双染色流式细胞仪测定脾细胞凋亡率  流式细胞仪(BRYTE HS型)为美国Biorad公司的产品。凋亡试剂盒购自晶美生物工程上海分公司。按照Annexin VFITC凋亡试剂盒说明步骤进行。结果判断：荧光显微镜下可见凋亡细胞呈绿色荧光，坏死细胞呈红绿或黄绿荧光。双标记流式细胞仪上散点图可见左下象限显示活细胞(FITC-/PI-)，右上象限显示坏死细胞(FITC+/PI+)，而右下象限为凋亡细胞(FITC+/PI-)。

　　1.5  统计学处理  应用SPSS10.0软件对数据进行统计分析，组间比较采用t检验，各组指标均以±s表示。

　　2  结果

　　2.1  两组大鼠血清IFNγ、IL4和 IFNγ/IL4比较  更年期组大鼠血清IFNγ质量浓度明显高于年轻组(P<0.01)；更年期组血清IL4质量浓度与年轻组相比有下降趋势，但差别无统计学意义(P>0.05)；更年期组血清IFNγ/IL4比值明显高于年轻组(P<0.01，表1)。

　　表1  两组大鼠血清 IFNγ、 IL4和IFNγ/IL4比较（略）

　　Table 1  Concentrations of  IFNγ, IL4 and IFNγ/IL4 of two groups

　　2.2  两组大鼠脾细胞凋亡率  年轻组脾细胞凋亡率为(7.7±2.3)% ，更年期组为(10.3 ±4.1)%，更年期组高于年轻组(P<0.05)。双重染色流式细胞散点图见图1。

　　图1  annexin V FITC/PI双重染色流式细胞仪检测脾细胞凋亡率（略）

　　Fig.1 Apoptosis of splenocytes detected by annexin VFITC/PI flow cytometry

　　a: Young group 5.7%; b: Menopausal group 10.2%

　　3  讨论

　　正常免疫功能的维持依赖于Th1/Th2的平衡和适度的淋巴细胞凋亡。Th1主要分泌IFNγ、IL2、TNF等Ⅰ型细胞因子，参与细胞毒性T细胞(CTL)介导的细胞免疫，在抗细胞内感染(如病毒感染、结核分枝杆菌感染等)中发挥重要作用；而Th2主要分泌 IL4、IL5、IL6 、IL10等Ⅱ型细胞因子，其功能在于刺激B细胞增殖及嗜酸性粒细胞活化，促进抗体(IgG1与IgE)产生，参与体液免疫，在抗细胞外感染与致敏原引起的免疫应答中起重要作用。研究发现[2,4]，老年人外周血CD+4T细胞产生的IFNγ高于年轻组，而IL4降低，提示老年个体有Th1极化现象。本实验结果表明，更年期组大鼠血清IFNγ质量浓度高于年轻组，更年期组血清IFNγ/IL4比值明显高于年轻组。提示更年期组大鼠Th1/Th2平衡向Th1漂移，削弱了老年机体对抗细胞外微生物感染的能力并使一些由Th1型细胞因子介导的自身免疫性疾病病情加重。

　　细胞凋亡是多细胞生物生命活动中不可缺少的组成内容，多种疾病都与过多或过少的细胞凋亡有关，如艾滋病、癌症、自身免疫性疾病及衰老。在衰老淋巴细胞中，DNA的修复能力降低，细胞发生凋亡的数量及频率均增加。资料显示：老年人外周血淋巴细胞凋亡比年轻人多，而且在老年肺心病患者外周血淋巴细胞凋亡与疾病的复发与恶化有关[5]。又有研究发现，在老年机体纯真T细胞数量大幅度减少，记忆T细胞增加，但是，记忆T细胞和NK细胞功能出现减退[67]。本实验结果表明，更年期组脾细胞的凋亡率高于年轻组。提示随着年龄的增长，更年期大鼠比年轻大鼠的免疫细胞更易发生凋亡，而且凋亡的发生可能是不适当和不成比例的，最终导致衰老机体的免疫功能减退和免疫功能发生重塑。

　　对凋亡机制的研究目前尚处于初级阶段。研究表明[8]，T细胞凋亡率增高与细胞表面Fas/FasL表达增加密切相关，而细胞因子能影响活化诱导的淋巴细胞凋亡[3]。Oyaizu等[9]在研究由HIV1型病毒诱发的交叉连接的CD4分子(CD4XL)引起大量外周血T淋巴细胞凋亡机制时发现：CD4XL通过增加外周血淋巴细胞分泌IFNγ和TNF上调淋巴细胞表面Fas抗原的表达，从而使淋巴细胞凋亡明显增加；抗IFNγ或抗 TNF抗体可阻断这种作用。本实验结果表明，与年轻组相比，更年期组大鼠外周血IFNγ质量浓度升高，Th1/Th2平衡朝Th1漂移；更年期组大鼠脾细胞凋亡率增加。脾脏是最大的外周淋巴器官，富含T、B淋巴细胞。本实验结果结合前面的研究结果推测：大鼠血清IFNγ水平的升高可能是引起大鼠脾细胞凋亡增加的一个重要原因。

　　综上所述，随着增龄更年期大鼠的细胞因子模式发生改变， Th1型细胞因子IFNγ分泌增加；同时更年期大鼠的脾细胞凋亡增加。IFNγ使淋巴细胞表面Fas抗原表达上调，可能是引起衰老大鼠淋巴细胞凋亡增加的重要原因。本研究为通过改变细胞因子模式，纠正Th1/Th2失衡途径来部分阻止衰老机体淋巴细胞凋亡，干预免疫衰老提供了实验依据。

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　　[1]Monti D, T roiano L, Grassilli E, et al. Cell proliferation and cell death in immunosenescence [J]. Ann N Y Acad Sci, 1992, 663:250261.

　　[2]SakataKaneko S, Watatsuki Y, Matsunage Y, et al. Altered Th1/Th2 commitment in human CD+4T cells with aging [J]. Clin Exp Immunol, 2000,120(2):267273.

　　[3]Green DR, Scott DW. Activationinduced apoptosis in lymphocyte [J]. Curr Opin Immunol, 1994, 6(3):476487.

　　[4]Kamada M, Irahara M, Maegawa M, et al. Transint increase in the levels of Thelperl cytokines in postmenopausal women and the effects of hormone replacement therapy [J]. Gynecol Obstet Invest, 2001,52(2):8288.

　　[5]朱健，唐靖渭，李宁丽,等. 老年慢性肺心病患者外周血淋巴细胞凋亡的研究 [J]. 中华老年医学杂志, 1998,17:23.

　　[6]Clerici M, Sarin A, Coffman RL, et al. Type 1/type 2 cytokine modulation of Tcell programmed cell death as a model for human immunodeficiency virus pathogenesis [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(25):1181111815.

　　[7]Iller RA. Immune system [M]. Masoro E. Handbook of Physiology: Aging. New York, Oxford University Press,1995: 555590.

　　[8]Aggarwal S, Gupta S. Increased apoptosis of T cell subsets in aging humans: altered expression of Fas(CD95), Fas ligand, Bcl2, and Bax [J]. J Immunol, 1998,160(4):1627-1637.

　　[9]Oyaizu N, McCloskey TW, Than S, et al. Crosslinking of CD4 molecules upregulates Fas antigen expression in lymphocytes by inducing interferongamma and tumor necrosis factoralpha secretion [J]. Blood, 1994, 84(8):26222631.