对氧磷酶
【关键词】 冠心病；对氧磷酶；基因多态性；相关性
摘要：目的 确定对氧磷酶1(PON1)基因192位GlnArg多态性与陕西地区汉族冠心病(CHD)患者发病之间的关系。方法 对动脉造影确诊的222例冠心病患者和164例非冠心病患者，采用PCR酶切法检测PON1基因192位GlnArg多态性并进行对比分析。结果 陕西地区汉族人群等位基因R和Q频率分别为60.23%和39.77%，其中CHD组RR、QR、QQ基因型分别占41.44%、39.64%、18.92%，对照组RR、QR、QQ基因型分别占35.98%、45.73%、18.29%；CHD组等位基因R频率占61.26%，Q频率占38.74%，对照组的等位基因R频率占58.84%，Q频率占41.56%，组间比较无显著性差异(P>0.05)；心肌梗死和非心肌梗死、冠状动脉病变不同程度间等位基因R和Q频率及RR、QR、QQ基因型之间无显著性差异(P>0.05)。结论 陕西汉族人群PON1192位GlnArg基因多态性与CHD发病之间无相关性。
关键词：冠心病；对氧磷酶；基因多态性；相关性
Clinical study on the relationship between PON1 192 GlnArg polymorphism and Han patients with Coronary heart disease in Shaanxi
ABSTRACT: Objective To investigat the relationship between PON1 192 GlnArg gene polymorphisms and coronary artery lesions in Shaanxi Han Chinese. Methods A total of 222 cases with one or more than two branches narrow (≥50%) and 164 cases with no coronary artery narrow(<30%), were diagnosed by coronary angiography. PON1 192 GlnArg gene polymorphisms were tested by PCRrestriction enzyme digestion in these two groups and analyzed. Results The frequencies of Arg (R) and Gln (Q) in Han population of Shaanxi province were 60.23% and 39.77%, respectively. The frequencies of RR, QR and QQ genotypes of PON in CHD group were 41.44%, 39.64% and 18.92%, respectively; and those in control group were 35.98%, 45.73% and 18.29%, respectively; the frequencies of R and Q allele in CHD group were 61.26% and 38.74%, and those in control group were 58.84% and 41.56%. No differences were found in PON gene GlnArg polymorphisms between myocardial infarction and non infarction groups, and no differences were found among different narrow degrees of coronary artery (P>0.05). Conclusion There was no relationship between PON1 192 GlnArg gene polymorphisms and Shaanxi Han patients with coronary heart disease.
KEY WORDS: coronary heart disease; paraoxonase1; gene polymorphism; relationship
对氧磷酶1(paraoxonase1, PON1)是由肝脏合成的芳香酯酶，具有保护高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein, HDL)的作用。研究显示PON1是惟一与HDL结合并防止低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)被氧化修饰的蛋白，其表型由PON1 192 GlnArg决定。近年就PON1多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease, CHD)相关性的研究，结论不一。国内包括地区数家单位对国人PON1R192与CHD的相关性进行了研究[14]，但结果互为矛盾。我们对陕西地区汉族CHD患者PON1基因多态性进行检测，以确定该多态性与CHD发病之间的相关性。
1 材料与方法
1.1 研究对象 选取2003年3月至2004年8月连续收住西安大学医学院第一附属心血管内科的陕西地区汉族患者386例，其中CHD患者222例(CHD组)，年龄45-78(58.22±8.10)岁；非CHD对照组164例，年龄34-76(57.70±8.50)岁。每位患者入院时均经过询问病史、体格检查、X线检查、心电图、超声心动图、以及相关实验室检查等并进行冠状动脉造影。排除有亲缘关系、急慢性肝肾疾病、肿瘤、脑血管病、周围血管性疾病等。
1.2 冠状动脉造影 采用荷兰飞利浦公司生产的Integris H5000C型数字减影机，按Judkins法依次行CAG，常规多体位投照，冠脉造影片均经过至少两位有经验的专业医生阅读，阅读前均不知本研究内容。采用直接法定量冠脉造影分析软件测定病变血管的狭窄程度。
1.3 分组方法 按CAG结果分组： 左冠脉主干、左前降支、左回旋支及右冠脉中至少一支血管狭窄程度≥50%者入CHD组；未发现冠脉狭窄或狭窄程度<30%者入对照组。按冠脉病变狭窄程度分组： 左前降支、左回旋支或右冠脉中任何一支血管均无狭窄或狭窄程度<30%为0支病变；左前降支、左回旋支或右冠脉中任何一支血管狭窄程度≥50%者为1支病变；任何2支或3支血管狭窄程度≥50%者分别归为2支病变组及3支病变组。对于左冠脉主干病变者，无论左前降支及左回旋支有无病变，均归为2支病变组，若同时合并右冠脉病变则归为3支病变组。
1.4 血标本采集 患者于行CAG术前空腹取外周静脉血20mL，置于密闭干燥管中，注入含有5g/L EDTANa 30μL和抑肽酶40μL试管中混匀，2h内于4℃ 3000r/min离心10min，分离血浆，血细胞成分于-80℃冰箱保存待提取DNA。
1.5 观察指标 采用酚氯仿法提取DNA，PCR扩增引物由TaKaRa大连宝生物工程有限公司合成。引物序列如文所示，上游引物序列：5′TATTGTTGCTGTGGGACCTGAG3′，下游引物序列：5′CACGCTAAACCCAAATACATCTC3′。PCR反应条件为： 95℃预变性5min，95℃变性1min，62℃退火45s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸7min。PCR酶切法检测PON1192位GLN/ARG基因多态性：限制性内切酶反应体系 20μL，PCR产物12.5μL(10mmol/L)；内切酶10×NEB缓冲液2.0μL，AlwI限制性内切酶0.5μL(5u/μL)，加去离子水5μL。轻轻混匀后，置37℃消化过夜。采用20g/L琼脂糖凝胶电泳，在常温、离子强度为1×TAE条件下，70V恒压电泳1h，分离AlwI酶切产物。紫外分析仪下观察目的片断，共产生3种基因型： RR、QR、QQ。RR基因型出现67bp和34bp各2条带；QR基因型出现100bp、67bp和34bp各3条带；QQ基因型出现100bp 1条带。
1.6 统计学处理 所有数据均输入机，用SPSS11.0/PC软件包进行统计分析。率间的比较用χ2检验，P<0.05为有统计学意义。根据HardyWeinberg平衡定律计算各基因型个体数的期望值，以χ2检验进行HardyWeinberg平衡吻合性检验。
2 结果
2.1 PON1 192位GlnArg基因型 依据AlwI酶切位点的存在与否判断其基因型，共产生3种基因型(图1)。
图1 限制性内切酶AlwI消化PCR扩增产物的琼脂糖电泳图谱（略）
Fig.1 AlwI restriction enzyme cutting results by agarose gelelectrophoresis
1,4: genotype RR(34bp and 67bp fragments); 2: genotype QR(34bp, 67bp and 100bp fragments); 3: genotype QQ(100bp fragment); M: molecular weight marker(34-500bp fragments)
2.2 基因型与等位基因频率 本研究共分析了386例PON1192基因AlwI酶切位点限制性片段长度的多态性。R和Q等位基因频率分别为60.23%和39.77%。基因型RR、QR和QQ分别占39.12%、42.23%和18.65%，基因分布为QQ 2.3 PON1192位GlnArg基因多态性与冠心病发病的关系 CHD组RR、QR、QQ基因型分别占41.44%、39.64%、18.92%，等位基因R和Q频率占61.26%和38.74%；而对照组RR、QR、QQ基因型分别占35.98%、45.73%、18.29%，等位基因R和Q频率分别占58.84%和41.56%。CHD组与非CHD组之间PON1192基因型和等位基因比较无显著性差异(P>0.05，表1)。 表1 CHD组与对照组PON1192位GlnArg基因多态性的分布（略） Table 1 The distribution properties of PON1192 GlnArg genotypes and the frequency of alleles in CHD group and control group square test: P>0.05 2.4 PON1192 GlnArg基因多态性与冠脉病变程度间的关系 不同冠脉病变程度(0、1、2及3支病变)PON1192各基因型、等位基因间无显著性差异(P>0.05，表2)。 表2 PON1192位基因多态性与冠状动脉狭窄程度的关系（略）
Table 2 The relationship between PON1192 GlnArg polymorphisms and narrow degrees of coronary artery
square test: P>0.05
2.5 PON1192 GlnArg基因型多态性与心肌梗死间的关系 心肌梗死患者RR、QR、QQ分别占42.99%、41.19%、16.82%，等位基因R和Q分别是63.08%和36.92%；非心肌梗死患者RR、QR、QQ分别占40%、39.13%、20.87%，等位基因R和Q分别是59.57%和40.43%。心肌梗死患者与非心肌梗死患者之间PON1192基因型和等位基因比较无显著性差异(P>0.05，表3)。
表3 CHD患者PON1192 GlnArg基因型多态性与心肌梗死之间的关系（略）
Table 3 The relationship between PON1192 GlnArg polymorphisms and myocardial infarction
square test: P>0.05
3 讨论
近年来，虽然通过改变人们的生活方式，新的药物的研发和先进医疗技术的应用，挽救了无数患者的生命，但CHD的发病率及死亡率在全球仍位居第一。众所周知，HDL抗动脉粥样硬化的特性是其作为胆固醇逆转运过程中的脂质转运体，即将多余胆固醇从周围组织转运到肝脏进行代谢。其次，HDL可通过抑制LDL氧化修饰发挥抗动脉硬化作用。HDL抗动脉硬化的作用，虽然还没有一个确定的解释，但越来越多的证据表明， HDL的抗氧化作用及抗动脉硬化的作用主要归功于与其相关的各种蛋白成分。PON1是其中的酶类之一。研究表明[57]，PON1多态性可影响HDL遏制动脉粥样硬化和预防炎症的能力。Mackness等[8]了8个实验室报告的PON1 192位基因多态性与冠心病关系的病例对照研究，结论不一致。在120例印度冠心病患者中，基因型Q和R频率分别为75%和25%，R等位基因的频率在冠心病患者(0.45)高于对照组(0.17)。所以，认为PON1基因多态性可能通过一种非脂质氧化的机制与冠心病易感性有关[9]。与此相反，Ko 等[3]在华人218例经血管造影证实为冠心病的患者以及同样数目、年龄、性别匹配的对照组研究显示：台湾华人PON1基因192位多态性与冠心病无明显相关。
本研究对386例陕西汉族人群PON1192 GlnArg基因型多态性进行了分析，结果显示等位基因R和Q频率分别为60.23%和39.77%，基因型RR、QR和QQ分别占39.12%、42.23%和18.65%；进一步分析发现CHD组RR、QR、QQ基因型分别占41.44%、39.64%、18.92%，对照组RR、QR、QQ基因型分别占35.98%、45.73%、18.29%；CHD组等位基因R频率占61.26%，高于对照组的58.84%，而等位基因Q频率占38.74%，低于对照组的41.56%。两组间无显著性差异(P>0.05)。
对心肌梗死和非心肌梗死患者PON1192位基因多态性进行分析发现，心肌梗死患者RR、QR、QQ分别占42.99%、41.19%、16.82%，非心肌梗死患者RR、QR、QQ分别占40%、39.13%、20.87%，心肌梗死患者等位基因R频率在心肌梗死占63.08%， 高于非心肌梗死患者的59.57%，而等位基因Q频率占36.92%，低于非心肌梗死患者的40.43%。PON1192 GlnArg基因多态性在心肌梗死和非心肌梗死患者间经统计学处理无显著性差异(P>0.05)。与Pati N[9]研究认为PON1192R与心肌梗死患者的相关性较非心肌梗死患者更强的结果不一致。
我们还分析了不同冠状动脉狭窄支数与PON1192 GlnArg基因多态性各亚型间的关系，结果显示1支病变基因型RR、QR和QQ分别占39.12%、42.23%和18.65%，等位基因R和Q频率分别占60.14%和39.86%，2支病变基因型RR、QR和QQ分别占41.18%、40%和18.82%，等位基因R和Q频率分别占61.18%和38.82%，3支病变基因型RR、QR和QQ分别占42.86%、39.68%和17.46%，等位基因R和Q频率分别占62.70%和37.30%。分析显示PON1192 GlnArg基因多态性在不同冠状动脉病变程度间无显著性差异(P>0.05)。
上述结果提示陕西汉族人群PON1192 GlnArg基因型多态性与CHD、心肌梗死以及冠状动脉狭窄程度之间无相关性。说明在陕西地区汉族人群中，还存在着除遗传因素以外的其他能引起CHD的因素，如饮食因素和环境因素等，这还有待进一步的研究。
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