中药复方君子汤联合环孢霉素A逆转白血病细胞株 K562/VCR耐药性的实验研究

                作者：廖斌,葛仁英,陈霞,皇甫真萍,齐彦,宋永平,魏旭东

【摘要】  本研究观察中药复方君子汤（FFJZ）联合环孢霉素A(cyclosporine A,CsA)逆转白血病耐药细胞系K562/VCR细胞耐药性的效果，以便寻找有效的联合逆转剂。采用MTT法、流式细胞术研究FFJZ联合CsA逆转白血病耐药细胞系K562/VCR耐药性的作用。结果表明：FFJZ联合CsA在体外对K562/VCR细胞的耐药性有明显的逆转作用（p＜0.01)，能提高K562/VCR细胞对阿霉素（ADM）的敏感性，且在药物有效浓度范围内对细胞本身无毒性作用。FFJZ联合CsA对K562/VCR细胞的P?gp表达的阳性率无明显影响。结论：复方君子汤联合环孢霉素A可能成为白血病多药耐药的安全有效的耐药逆转药物。

【关键词】  白血病

    Synergistic Reversal Effect of   Chinese Medicine Compound FFJZ Combined with  Cyclosporine A  on Multidrug Resistance of Leukemia K562/VCR Cell Line

          Abstract    The study was purposed  to investigate the synergistic reversal effect of Chinese medicine compound FFJZ in combination with cyclosporine A(CsA) on the multidrug resistance (MDR) of human leukemia K562/VCR cell line，as  to search effective combination of MDR  modulators. MTT (methyl?thazol?tetrazolinum) assay were used to determine the cytotoic  and  reversal effects on K562/VCR cell line, FCM (flow cytometry) was used to assess the intracellular adriamycin (ADM) concentration and the expression of P?gp in cells.   The rasults showed that the FFJZ in combination with CsA could reverse the   drug?resistance of  K562/VCR cells  and increase the  sensitivity K562/VCR cells  to adriamycin.   They had not the toxic effect on the K562/VCR cells in effective dose and  no significant  influence  on  P?gp positive rate of the K562/VCR cells. It is concluded that  the  FFJZ in combination with CsA may become a safe and effective multidrug  resistance?reversing agent with low toxicity in leukemia chemotherapy.

    Key words    leukemia；multidrug resistance； Chinese medicine compound FFJZ；cyclosporine  A；K562/VCR cell；P?glycoprotein

    多药耐药(multidrug resistance,MDR)，即在化疗初期效果好，但经过几个疗程治疗后，肿瘤细胞不但对所用药物有耐药性，而且对其他结构和作用机理不同的多种来源的药物也产生交叉耐药性，导致联合化疗方案失败。中医中药用于肿瘤治疗是我国特有的传统治疗手段。目前的研究显示，中医药对肿瘤的防治与康复均具有重要作用，可协同化疗药物发挥增效减毒的作用。因此，从中药复方中寻找高效低毒的MDR逆转剂成为肿瘤研究中的一个热门课题，而且是可行途径。本实验观察复方君子汤(FFJZ)与环孢霉素A(CsA)联合应用对白血病耐药细胞耐药性的逆转作用，并初步分析其作用机理，为今后研究提供依据。

    材料和方法

    细胞

   中药复方君子汤联合环孢霉素A逆转白血病细胞株K562/VCR耐药性的实验研究人红白血病耐药细胞株K562/VCR和敏感细胞株K562均由河南省肿瘤中心实验室惠赠。

    药物和试剂

    FFJZ（主要成分：党参、白术、茯苓、黄芪、川芎、浙贝、绞股蓝、补骨脂、甘草）由河南省肿瘤医院中药制剂室提供；注射用盐酸长春新碱为广州明兴制药厂的产品；MTT为Serva公司产品；胎牛血清（BSA）, 250毫升/瓶，为Sigma产品；台盼蓝为Chroma进口产品，由上海化学试剂分装厂分装）；PRMI 1640培养粉为美国Gibco公司产品；二甲亚砜（DMSO）， 500毫升/瓶，为北京化工厂生产；Pg?p单克隆抗体为美国Coulter公司产品；环孢霉素A(CsA)为瑞士Sandoz公司产品；注射用盐酸阿霉素(ADM），10毫克/支，为浙江海正药业股份有限公司产品。

    主要仪器

    OLYMPUS倒置相差显微镜：IX71型，日本生产；水套式CO2培养箱：CJ?1100型，长沙长棉应用技术研究所生产；手提式蒸汽灭菌器：YX280B型，上海医疗器械厂生产；干燥箱：101A?1型，编号0057，上海实验仪器总厂生产；酶联免疫检测仪：DG3022A型，人民解放军第四军医大学国营华东管厂生产；流式细胞仪：Coulter EPICS型，Beckman Coulter公司产品。

    细胞培养

    K562细胞培养用RPMI 1640培养液(含10%小牛血清、链霉素及青霉素各100 U/ml),于37℃、5% CO2、100%湿度培养箱中培养。K562/VCR培养条件与K562相同,仅培养液中另加1 μg/ml长春新碱［1］。K562及K562/VCR每2-3天换液1次。K562/VCR于试验前脱药培养4代。所有试验均取指数生长期细胞进行。

    细胞耐药性实验(MTT法) ［2］

    取对数生长期的K562/VCR和K562细胞(2×105/ml,100 μl/well)接种于96孔板内,由低到高浓度(设5个浓度梯度)分别加入中药制剂FFJZ (2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/ml);CsA(0.5、1、2、4、8 mg/L);VCR(K562/VCR）: 2.5、5、10、20、40 mg/L; K562：0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L),每个浓度设3个平行复孔,并设阴性对照组,共同孵育48小时,更换新鲜培养液,每孔加入MTT(5 mg/L)20  μl,继续培养4小时,平板离心机离心(1 500 r/min,10分钟),弃上清液,可见蓝紫色结晶,加入DMSO 100 μl,摇匀,振荡10分钟,在酶标仪测定490 nm处的吸光度(Ａ)。实验重复3次。先推算药物的半数抑制浓度(IC50),然后依公式耐药指数(resistance factor,RF)，其公式为：

    RF=耐药细胞株IC50∕敏感细胞株IC50

    细胞耐药性逆转实验

    采用MTT法［2］取对数生长期的K562/VCR和K562细胞(2×105/ml)接种于96孔板内,先加入无毒性剂量的FFJZ、CsA、FFJZ+CsA,15分钟后由低到高浓度加入VCR(5个浓度梯度,同上),每个浓度设3个平行复孔,并设阴性对照组,其余方法同细胞耐药性实验。实验重复3次。按公式计算逆转指数(reversal index，RI)，其公式为：

    RI= VCR组IC50∕逆转剂+VCR组IC50。

    细胞内ADM的流式细胞术测定［3］

    K562、K562/VCR经CsA, FFJZ和CsA+FFJZ处理72小时后,收集细胞制成1×106/ml的细胞悬液，加入ADM，孵育4小时后PBS洗去游离ADM，用流式细胞仪测定10 000个细胞内ADM被激发的相对荧光强度（发射波长490 nm），以代表其在细胞内的浓度。

    P?gp表达的流式细胞术检测

    K562/VCR经CsA, FFJZ和CsA+FFJZ处理72小时后,收集细胞制成1×106/ml的细胞悬液,用PBS洗涤,加入P?gp单克隆抗体4℃避光反应30分钟,用PBS洗涤后重悬,流式细胞仪检测细胞P?gp阳性率和平均荧光强度［3］。

    统计学处理

    计量资料数据统计用均数±标准差(±SD)；两组均数之间比较采用t检验；多组均数之间比较，方差分析(F检验)，采用SPSS 11.0统计软件包统计分析。

    结    果

    细胞耐药性MTT比色法测定

    结果见表1。FFJZ的半数抑制浓度（IC50）为5 mg/ml左右,CsA的IC50为1 mg/L左右,两者耐药指数(RF)均为1，认为对K562/VCR细胞既无增强耐药性作用，也无毒副作用,而VCR对K562/VCR细胞的IC50为13.66 mg/L左右,对K562细胞的IC50为0.02 mg/L左右,其RF为712,因此本实验中FFJZ,CsA的浓度选择无毒性剂量,分别为5 mg/ml和1 mg/L。

    FFJZ、CsA 、FFJZ＋CsA对K562/VCR细胞耐药性的逆转作用

    结果见表2。FFJZ和CsA分别在5 mg/ml和1 mg/L (无毒性剂量)时,VCR对敏感细胞株K562细胞的IC50影响不明显(p>0.05),但对耐药细胞株K562/VCR细胞的耐药性有明显逆转作用(P<0.01)，而且FFJZ＋CsA组逆转指数（RI）相当于FFJZ或CsA单独使用逆转指数的2倍以上。

     FFJZ、CsA和FFJZ+CsA对K562/VCR细胞内ADM浓度的影响

    流式细胞术检测发现：K562/VCR、K562/VCR+FFJ2、K562/VCR+CsA和K562/VCR+FFJ2+CsA组与对照组1比较，差异非常显著（P<0.01），K562/ VCR+FFJ2、K562/VCR+CsA和K562/VCR+FFJ2+CsA组与对照组2比较，差异显著（P<0.05），无论CsA和FFJZ单独或联合处理,耐药细胞株K562/VCR细胞内ADM荧光强度明显增强，但恢复不到敏感细胞株K562细胞内水平（表3）。

   FFJZ、CSA和FFJZ+CSA对K562/VCR细胞P?gp表达的影响

    Figure. Influence of FFJZ and CsA on P?gp expression of K562/VCR cells.

    检测发现,无论CsA和FFJZ单独或联合对K562/VCR细胞P?gp表达的阳性率均无明显影响(附图)。综合以上的结果，初步推测CsA和FFJZ并不是通过抑制K562/VCR细胞mdr1/P?gp的表达,而是通过抑制P?gp的功能增加细胞内药物积聚而达到逆转耐药的作用。

    讨    论

    急性白血病（acute leukemia，AL）是对化疗有反应且诱导缓解率较高的恶性肿瘤,但对多种化疗药物的耐受是其成功的主要障碍之一。虽然已经发现，如VRP、蛋白激酶C抑制剂(PKI)等药物具有一定逆转作用,但临床应用发现西药具有作用机制单一、选择性差，中毒剂量与有效剂量接近等缺点，因而其临床应用受到限制。解决白血病细胞多药耐药的问题已成为国内外学者的研究热点。近年来国内外已有CsA逆转白血病细胞多药耐药的报道,CsA是一种自真菌分离出的环形肽类,主要用于临床器官移植病人。CsA作为一种P?gp拮抗剂已用于临床，给予常规剂量［15 mg/（kg·d）左右］，体内药物浓度可达体外逆转所需水平［5］,但CsA存在肾毒性及免疫抑制作用,从而限制了它的临床应用。

    中药毒副作用小，大多数中药复方、单体成分或有效部分无明显的毒副作用，目前证实有逆转作用的中药在体内易于达到有效逆转耐药的浓度，而对心血管系统、免疫系统等不产生毒副作用，并且不提高抗癌药物在敏感的肿瘤细胞与正常组织细胞内的蓄积浓度。在实施化疗方案的同时联合使用中药具有对正常组织细胞的保护效应，从而保证临床用药的安全性。这是西药逆转剂所不能比拟的,但是中药逆转肿瘤耐药也存在一些问题，例如逆转倍数相对较低［6］。本研究的复方君子汤是我们的经验方,经过长期的临床实践,发现它对恶性肿瘤的化疗有增敏作用,由于复方君子汤是中药复方制剂,成份复杂,作用机理不清,浓度单位也仍采用相当于生药剂量的浓度，本研究结果证实了FFJZ在体外对白血病耐药细胞株K562/VCR细胞的耐药性有明显逆转作用，增加阿霉素（ADM）在K562/VCR细胞内的浓度，因此具有一定的逆转MDR作用，而且作用强度接近于CsA。

    CsA的耐药逆转作用较强,但毒副反应也较强,而FFJZ的逆转作用虽然相对较弱,但无明显不良反应,且可减小CsA的用量以减轻其临床不良反应，两者联合对耐药细胞株K562/VCR细胞的耐药性有明显逆转作用，而且逆转指数（RI）相当于FFJZ或CsA单独使用逆转指数的2倍以上。有效逆转浓度联合对K562和K562/VCR细胞无明显毒副作用,能提高K562/VCR耐药细胞株对阿霉素（ADM）的敏感性，可协同逆转耐药细胞对化疗药物的耐药性，为临床两药联合应用，特别是减少CsA用量以减低其不良反应提供了依据。从以上结果可以看出,采用中西医结合逆转白血病细胞的多药耐药性是可行的。

【】
  1张淑清,冯敏,殷建林等.多药耐药细胞系K562/VCR的建立及生物学特性的研究.中华血液学杂志,1992;13:622-624

2Ruefli AA, Smyth MJ, Johnstone RW. HMBA induces activation of a caspase?independent cell death path way to overcome P?glycoprotein?mediated multidrug resistance. Blood, 2000;95: 2378-2385

3何一心,杨少光,张淑靖等.多药耐药性细胞的鉴别和分离.中华血液学杂志, 1992;13:173-175

4Fu JX, Wang W, Cen JN, et al. Retroviral mediated efficient transfer and expression of multiple drug resistance gene to human leukemia cells. Chin J Cancer Res, 2000;12:120-124

5List AF, Spier C, Grear J, et al. Phase/trial of cyclosporine as a chemotherapy resistance modifier in acute leukemia. J Clin Oncol, 1993;11:1652-1660

6林洪生.中医防治肿瘤的成绩与思考.肿瘤, 2002;1:16-17??