HBV慢性感染与树突状细胞功能异常研究进展

【关键词】  树突状细胞;HBV慢性感染;CTL应答;拉米夫定

我国是HBV感染高流行区，一般人群HBsAg阳性率约为9.09%，慢性乙型肝炎患者约3千万人。乙型肝炎病毒（HBV）持续感染的机制虽仍不完全清楚，但大量实验表明，树突状细胞（dendritic cell DC）功能异常可能是其主要原因。早期人们注意到感染者体内细胞因子的表达水平与树突状细胞的功能异常有关，近年来又发现HBV感染本身也影响DC成熟，并针对提高DC功能的抗HBV进行了有益的探讨。本文综述HBV慢性感染与树突状细胞功能异常研究进展。
    
　　1 DC分类与功能
    
　　DC呈树突状的外形，通常以未成熟形态居于外周组织 ［1，2］ ，具有强大的吞噬能力，而移动能力很低，能非常有效地摄入抗原和处理可溶性蛋白，仅低表达CD54、CD40、CD80等共刺激分子和粘附分子，高表达CD86和HLA-DR。当受到外来物质或细胞因子刺激时，则成为成熟的DC。成熟的DC吞噬能力下降，增殖能力亦有所下降，但其移动能力和抗原提呈能力却大大增强;MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD40、CD80、CD86、ICAM-1等协同刺激分子表达上调。体内的DC主要分为髓系DC（myeboid，mDC，DC1）和淋巴系DC（lymphooid，pDC，DC2）两类，均起源于多能造血干细胞。外周血单核细胞在GM-CSF和IL-4作用可产生非成熟髓系DC，在TNF-а或内毒素作用后变为成熟髓系DC。血液或扁桃体中CD4 + CD3 - CDllc - 浆细胞（DC2前体细胞）与IL-3作用后可产生非成熟淋巴系DC，在经CD40L作用后分化为成熟淋巴系DC。DC1与单核、粒细胞有共同的祖细胞，能分化发育成巨噬细胞，DC2与T、NK细胞有共同前体细胞，能分化为淋巴细胞。 一般认为，DC1其表面标志为Lin - HLA-DR + CD4 + CD11c + ，主要发挥抗原递呈作用，并分泌IL-12，作用于Th0使之向Th1型细胞分化;DC2其表面标志为Lin + HLA-DR + CD4 + CD123 + ，主要产生干扰素α，具有较弱的抗原递呈功能，并分泌IL-4，作用于Th0使之向Th2分化。DC是机体内功能最强的专职性抗原提呈细胞，具有激活CD8 + CTL和CD4 + Th的能力，在免疫应答中发挥重要作用。DC通过双信号机制启动抗原特异性的T细胞免疫应答，抗原提呈细胞将抗原捕获、加工成为肽段后，负载到主要组织相容抗原复合物（MHC）分子表面，形成启动T细胞免疫应答的第一信号，DC表面的共刺激分（CD80、CD86等）与抗原特异性T细胞表面的共刺激分子受体（CD28等）相结合，形成强烈的共刺激信号，即为第二信号。
      
　　2 慢性乙型肝炎患者的DC功能
      
　　DC作为体内免疫反应的始动子、调节子和效应子 ［3］ ，一旦受损会影响到机体免疫的各个环节 ［4］ 。慢性乙型肝炎患者外周血DC的数量与功能往往是有缺陷性。
      
　　2.1 DC数量及亚群比例的异常
      
　　国内研究者对73例感染者和25例HBsAb + 健康者进行检查，82%病人外周血中DC百分率明显低于健康者 ［5］ 。Beckebaum等发现，慢性乙肝患者体内mDC比例下降而pDC比例上升，因此mDC/pDC比值降低 ［6］ 。Kunitani等而却发现相关的慢性肝炎和肝硬变患者外周血mDC和pDC水平均下降 ［7］ 。国内研究者发现mDC在急性肝炎和慢性肝炎阶段无明显下降，到肝炎肝硬变阶段出现细胞比例和绝对数的下降。pDC数量在慢性乙肝阶段即降低，而肝炎肝硬变阶段pDC进一步降低。因此，pDC比mDC更早出现数量的降低。至于不同研究者结果不同，可能与病例选择、病人遗传背景等因素有关，具体机制需要进一步研究 ［8］ 。
 
　　2.2 DC功能的异常
      
　　慢性乙型肝炎患者DC表面表达的共刺激分子CD80、CD86、CD1a及HLA-DR的水平明显降低 ［9］ ，且分泌的Th1类细胞因子IFN-γ、IL-12的水平低于正常 ［10，11］ 。患者DC表面共刺激分子的减少，将会使DC抗原提呈能力的下降，使DC不能有效的激活特异性的CD4 + 的Th细胞与CD8 + 的CTL细胞。而患者DC分泌IL-12水平的缺失，则是慢性乙型肝炎患者DC刺激T淋巴细胞增殖能力降低的另一个重要原因。IL-12是DC细胞释放的迄今为止所发现的最有效的CTL和NK细胞活性刺激因子。IL-12可促进由丝裂原激活的CTL和NK细胞的增殖，增强这两种细胞的细胞毒作用并诱导其IFN-γ产生，同时增强许多效应细胞，如:NK细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）、T细胞以及巨噬细胞等的溶细胞活性。且IL-12可与共刺激分子协同作用，调节Th0细胞向Th1细胞的发育，促进Th1细胞分泌IFN-γ和IL-2，介导细胞免疫应答 ［4］ 。
    
　　 对慢性乙型肝炎患者DC进行混合淋巴细胞反应（MLR）检测发现，其刺激淋巴细胞增殖能力亦明显低于正常人。并且在MLR上清液及纯的DC培养上清液中其产生IL-12水平下降，而NO水平却升高。NO被认为可通过抑制多种酶的作用而损伤健康组织 ［9］ 。
     
　　用 3 H-TdR掺入法测定慢性乙肝患者DC的提呈抗原的能力，发现其DC的刺激指数低于正常，提示其抗原提呈能力较正常低下，诱导特异性免疫反应的能力就随之下降 ［10］ 。以往研究中发现慢性肝炎患者DC的抗原摄取能力并未受影响，只是出现成熟障碍 ［12，13］ 。国内研究者发现慢性肝炎患者DC的膜表面分子表达降低的同时，抗原摄取功能力也是降低的。郑曲波等人对73例感染者进行检测，大部份病人外周血中DC百分率明显低于健康者，而且凡是DC百分率低下者，在外周血中加入HBsAg进行孵育后，DC的百分率没有增加，提示HBV感染者外周血DC不仅数量减少，而且缺乏应答功能。进一步检测感染者的T细胞经激 活后的应答能力，发现感染者的T细胞应答功能也呈低下表现，其原因究竟是DC递呈功能异常抑或是T细胞本身应答功能异常所致，尚待深入研究 ［5］ 。范春蕾等人对HBV和HCV合并感染者的研究发现，DC的膜表面分子表达降低，同时抗原摄取功能及刺激异体淋巴细胞增殖的能力降低，但这并不影响机体对HBV或HCV的清除和抗原特异性的细胞免疫应答的产生。DC非病毒特异性免疫功能下降不是导致CTL作用不足以及肝炎病毒持续感染的原因，慢性HBV和HCV合并感染中HBV和HCV的清除均与体内是否存在特异性的CTL相关 ［14］ 。CTL对HBV清除至关重要，已有试验证实慢性HBV持续感染中CTL应答非常微弱，甚至检测不到 ［15］ 。病毒感染、CTL作用的不足和DC功能的异常总是伴随出现，但其相互作用的细节有待进一步研究。
     
　　HBV持续感染的原因可以解释为DC及前体受到病毒感染后，数量减少、表面共刺激分子表达下调，DC的抗原提呈和免疫调节功能受损，从而导致DC启动CTL和Th免疫应答低下，使HBV病毒无法彻底清除。
      
　　3 慢性乙型肝炎患者DC异常的机制
      
　　DC细胞数量和功能异常的原因可能与多种因素有关，其中DC被HBV感染是一个重要的因素。Beckebaum  ［6］ 和Arimas ［16］ 在DC内检测到了HBV的DNA及mRNA，说明DC可能也是HBV侵袭的一个肝外宿主。HBV病毒对DC的感染，可以诱导DC的凋亡，分泌细胞因子和刺激T细胞增殖的能力受到抑制 ［4］ ，从而导致DC数量减少、表面共刺激分子表达下调，DC的抗原提呈和免疫调节功能受损。有实验表明慢性乙型肝炎患儿mDC细胞数与HBV-DNA水平呈负相关，而在对成人慢性乙型肝炎患者的研究中发现mDC细胞数与血清HBV DNA水平无明显相关，提示乙型肝炎病毒对慢性乙型肝炎患儿mDC的抑制作用可能更强。慢性乙型肝炎患儿pDC细胞数与HBV DNA略呈负相关，但差异无显著性（P>0.05），在对成人慢性乙型肝炎患者的研究中提示pDC细胞数与血清HBV DNA水平呈负相关（P<0.01），原因考虑为:患者遗传和免疫背景差异导致pDC数量变化较大和功能差异;患者可能处在免疫清除状态的不同时期 ［17，18］ 。通过对16例慢性乙肝患者，进行48周拉米夫定抗病毒有治疗动态检测DC1及淋巴细胞亚群抗病毒前、中、后变化，证实DC1表面共刺激因子CD40、CD80可随着HBV病毒的有效抑制而得到部分恢复（P<0.05）。5例抗病毒后病毒变异（YMDD）致使对拉米夫定产生耐药的出现，DC形态、数量及其表面共刺激因子的表达无明显改善 ［4］ 。

      
　　4 DC抗HBV感染的应用前景
      
　　在慢性感染HBV的机体内，外周循环中的HBsAg不能引起完全的免疫应答，免疫调节机制和抗原提呈功能不足，而在体外用病毒相关抗原冲击致敏DC，再回输体内，DC就可以把HBV抗原提呈给T细胞，提高CTL和CD4 + Th功能，就可以打破免疫耐受、恢复细胞免疫应答，对有效清除HBV具有关键作用。
     
　　Thomas和Morse报道先后从外周血成功分离培养出DC，以DC为基础的免疫疗法应用于临床提供了依据。通常采用外周血中的单个核细胞（PBMC）或骨髓和血液中的CD34细胞作为前体细胞，加入GM-CSF，TNF-α，IL-4，IL-6和PGE2后，经过扩增和诱导成熟两个阶段而最终得到成熟DC，与HBV抗原（HBeAg/HBcAg）共培养，可得到HBV致敏的DC疫苗。其他一些细胞因子和物质，如CD40R，FLT3R，SCF和IL-12等也可以促进DC的成熟。Chisari实验室用HBV转基因小鼠进行研究发现:用含HBsAg DNA疫苗只能在一部分小鼠刺激抗体反应，但无特异CTL反应出现，而用IL-4，GM-CSF活化骨髓来源的DC疫苗在所有小鼠均能刺激脾细胞CTL反应 ［18］ 。李用国等人报道，在体外用慢性乙型肝炎患者自体DC负载HBsAg，给患者皮下注射，观察一系列临床指标，发现经抗原负载的DC可以有效抑制HBV的复制，降低血浆病毒载量，清除HBeAg和促进HBeAg/抗-HBe的血浆转化，ALT低于2×ULN的患者对HBsAg-DC同样也可出现应答反应，这使DC治疗的适应人群更为广泛 ［19］ 。
     
　　由于MHC-肽复合物半衰期较短，其寿命决定了CTL反应的效率，因此，要保持高水平的持久的抗病毒免疫效应，需要以致敏的DC反复刺激机 体。为了使DC能持续加工呈递病毒抗原多肽，可将病毒抗原多肽基因导入DC，使DC能持续表达基因产物于细胞表面，从而有效地诱导出特异性T细胞反应 ［20，21，22］ 。
     
　　对致敏DC的抗原的研究发现:HBcAg致敏的mDC，其表面分子表达、刺激淋巴细胞增殖能力的提高较用HBsAg致敏的mDC强。HBcAg抗原剂量过小不能增加DC表面分子的表达率，剂量过大DC表面分子的表达率并非最高，可见并不是抗原剂量越大对DC致敏效果越好 ［23］ 。
     
　　因为拉米夫定抗病毒治疗能部分恢复慢性肝炎患者体内DC表面共刺激分子CD80、CD40表达 ［19］ 。因此，药物抗病毒与DC疫苗联合的治疗方案值得进一步研究。
     

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