中国人Rh部分D表型的分子机理研究
作者：吴俊杰，洪小珍，许先国，何吉，傅启华，严力行
【摘要】 为了研究部分D表型的分子机理，用间接抗人球蛋白方法(IAT)筛选弱表达的D变异体，PCR-SSP（polymerase chain reaction-sequence sepecific primer）方法扩增RHD基因特异的外显子及其侧翼序列，用PCR产物直接序列分析测定核苷酸的变异。结果表明：从22例弱D中检测到10例部分D表型，其中D Va（Kou.）、D Va（Hus.）和D Va-like （YH.）各1例，D VI type Ⅲ表型7例。结论：10例部分D表型的分子机理得到明确，其中D Va（Kou.）、D Va-like （YH.）表型为国内首次报道。
【关键词】 Rh血型
Molecular Basis of Partial D Phenotypes in Chinese
Abstract To investigate the molecular basis of partial D phenotypes in Chinese，D variants with weak D expression was screened by using indirect anti-human globulin test ( IAT) method，the polymerase chain reaction-sequenc specific primer (PCR-SSP) method was employed to amplify RHD specific exons and their flanking regions. The amplification products were sequenced directly to determine the molecular basis of D variants. The results showed that ten cases of partial D phenotypes，including one case of D Va（Kou.），one case of D Va（Hus.），one case of D Va-like （YH.），and seven cases of D VI type Ⅲ，were detected from 22 cases of weak D phenotype respectively. All ten cases of partial D phenotypes had one RHD allele deleted. In conclusion，the molecular basis of ten cases of partial D phenotype was confirmed，including D Va（Kou.）and D Va-like （YH.）phenotypes reported firstly in Chinese population.
Key words Rhesus blood group; RHD gene; partial D; sequencing
Rh血型系统是目前已知的29个人类红细胞血型系统中最复杂的一个［1］。Rh血型的核心抗原包括RhD和RhCE（主要有ce、Ce、CE、cE 4种组合）蛋白，它们分别由1条417个氨基酸组成的肽链所编码。疏水性分析表明，它们都包括6个胞外环、12个跨膜区域和7个胞内环。RhD和RhCE多肽链仅有30-35个氨基酸的差异。D 抗原因为具有较强的免疫原性在临床上有重要的意义。对D抗原表位的分类已经从最初的7个细分到37个［1］。通过鉴定这些表位，可以明确部分D的具体表型。但是，目前针对这些表位的一系列单克隆抗体谱散布于国外一些大型的输血医学研究机构和血型参比实验室中，只有通过国外会议交流或者私人赠送的途径才能获得。因此，单克隆抗体的匮乏影响了部分D表型的血清学鉴定。另外一个有效的途径是从基因水平去研究D变异体的分子机理，明确其变异位点，从而鉴定部分D。目前，D变异体的分子机理研究已经有很多报道，但是对部分D表型的分子机理研究主要集中在白人、非裔黑人和日本人中，在人群中的相关研究报道很少［1］。我们从弱D中通过分子水平的研究鉴定了10例部分D表型，报道如下。
材料和方法
研究对象
以工作或者生活在浙江省的无偿献血员为研究对象。在2002-2004的3年研究期间，共收集到Rh阴性样本1 272例。根据抗D试剂说明，对Rh阴性血型做进一步的IAT实验确认，筛查得到22例弱D样本。对弱D样本做RHD基因序列分析，发现其中10例为部分D表型，12例为弱D表型。 本研究以10例部分D表型为研究对象。
Rh表型血清学鉴定
RhD表型鉴定采用常规盐水平板法或试管法，使用加拿大Dominion公司的NAVACLONETM混合单克隆抗D试剂（人单克隆IgM抗D，D175-2细胞株；人单克隆IgG抗D，D415 1E4细胞株）。根据试剂说明，盐水实验Rh阴性的Rh血型用IAT方法进一步确认。如果IAT实验阳性，并且直接抗人球蛋白实验阴性，则鉴定为弱D表型或者部分D表型；如果IAT实验阴性，则鉴定为Rh阴性。抗人球蛋白试剂用美国Immuco公司的兔源抗IgG。RhC、Rhc、RhE和Rhe鉴定采用盐水试管法，试剂为加拿大Titus公司的单克隆抗体。
基因组DNA提取
采用Puregene DNA 纯化试剂盒 (Gentra，Minneapolis，USA)，从枸橼酸钠抗凝的外周血中制备基因组DNA，严格按试剂说明书操作。
D杂合性检测和单倍体型推测
根据Perco等的方法［2］，用特异性引物u1-s和rnb31 PCR检测Rhesus hybrid box。如果可以扩增得到2 778 bp的特异性片段，表明存在Rhesus hybrid box，有RHD基因的缺失；反之，则不存在Rhesus hybrid box，没有RHD基因的缺失。最大可能的单倍体型根据RHCE基因的C/c和E/e等位基因和RHD基因是顺式共遗传，并且RHD基因缺失的单倍体型按cde推算。
PCR-SSP
参照Wagner等［3］和Legler等［4］的方法，根据RHD基因和RHCE基因内含子序列的差异设计10组特异扩增，包括RHD 基因外显子及其侧翼序列的PCR-SSP引物（表1）。PCR反应总体积50 μl，含模板DNA 1 μl（约25-50 ng），特异性引物终浓度250 nmol/L，MgCl2 终浓度1.5 mmol/L（TaKaRa公司，中国大连），dNTP终浓度 200 μmol/L (Promega公司，美国)，Taq酶1 U（TaKaRa公司）。PCR扩增条件：95℃ 预变性5分钟，然后94℃ 变性30秒、64℃ (外显子1、2、3、7)/67℃ (外显子4、6、8、9、10)/ 60℃ (外显子5)退火30秒和72℃ 延伸1分钟，循环35次，最后72℃延伸10分钟。PCR扩增仪为PE2700（Applied Biosystems公司，美国）。Table 1. Primers used in specific amplification and sequencing of RHD exons and their flanking regions（略）
PCR产物直接测序
PCR扩增产物用PCR产物纯化试剂盒 (Qiagen GmbH，德国)纯化后，直接用于序列分析反应。序列分析反应采用“BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Kit”试剂盒，DNA聚合酶采用AmpliTaq DNA Polymerase（Applied Biosystems公司，美国），最后用ABI 377 测序仪 (Applied Biosystems公司，美国)作序列分析。
结果
D杂合性检测
10例部分D都可以扩增得到2 778 bp的特异性片段，表明存在Rhesus hybrid box，有RHD基因的缺失。
10例部分D的分子鉴定
通过对RHD基因特异的外显子及两翼序列的扩增和序列分析，我们共检测到4类部分D的等位基因（表2）。Table 2. Molecular basis of ten partial D phenotypes in Chinese（略）
第1类等位基因有外显子5的667 T>G和697 G>C突变（图1），引起RhD蛋白第7个跨膜区域的223 Phe>Val和第4胞外环的233 Glu>Gln氨基酸的突变。根据报道，这是D Va（Kou.）表型［5］。只1例，可能的单倍体型为CDVae/cde。
第2类等位基因携带外显子5的667 T>G，676 G>C，697 G>C，712 G>A，733 G>C，744 C>T，787 G>A，和 800 A>T，共8个突变（图1），引起编码的RhD蛋白7个氨基酸突变（744C>T为无义突变）：223 Phe>Val、226 Ala>Pro、233 Glu>Gln、238 Val>Met、245 Val>Leu、263 Gly>Arg和267 Lys>Met，其中226 Ala>Pro、233 Glu>Gln、238 Val>Met突变位于RhD蛋白的第4胞外环，223 Phe>Val和245 Val>Leu突变位于跨膜区域，263 Gly>Arg和267 Lys>Met 突变位于胞内环。推测是RHD基因的整个外显子5通过RHD和RHCE基因的基因转换被RHCE基因外显子5替换所致，根据文献报道，这是D Va（Hus.）表型［5］。只1例，可能的单倍体型为CDVaE/cde。
第3类等位基因携带外显子5的667 T>G，676 G>C，697 G>C，712 G>A，733 G>C，和744 C>T，共 6个核苷酸突变（图1），产生223 Phe>Val、226 Ala>Pro、233 Glu>Gln、238 Val>Met和245 Val>Leu，共5个氨基酸突变（744C>T为无义突变）。其中226 Ala>Pro、233 Glu>Gln、238Val>Met突变位于RhD蛋白的第4胞外环，223 Phe>Val和245 Val>Leu突变位于跨膜区域。推测也是由RHD/RHCE基因外显子5的基因转换所致。根据文献报道［6］，这是D Va-like （YH.）表型。只1例，可能的单倍体型为cDVaE/cde。
第4类等位基因用PCR-SSP扩增RHD基因的外显子3-6呈阴性反应，外显子1、2、7、8、9和10（包括3’非翻译区）及其侧翼序列未见变异。推测RHD基因的外显子3-6被对应的RHCE基因替换，或者被替换的是RHD基因外显子2-6。根据Wagner［3］和Legler等［4，7］报道的PCR-SSP反应格局，这是DVI type Ⅲ表型。共7例，单倍体型CDDVae/cde。
讨论
决定D抗原特异性的氨基酸主要位于外显子4、外显子5和外显子7编码的D蛋白的第3、第4和第6胞外环［8］。这些胞外环氨基酸的单个或者多个错义突变以及RHD基因和RHCE基因外显子3-7之间的基因转换使得D蛋白特异的胞外环的氨基酸被CE蛋白的对应部分取代是构成部分D表型的两个主要分子机理。因为缺失D抗原特异的氨基酸所编码的D表位，部分D的血清学特征为表达不完整的D抗原，如果受到D阳性细胞（或者携带自身所缺失的表位的D细胞）刺激，会产生针对缺失表位的抗体。准确鉴定部分D表型对于指导临床输血和育龄妇女采取恰当的预防新生儿溶血病措施等有重要的意义［1］。
本研究运用RHD基因测序方法，从弱D样本中鉴定了10例部分D，其中D Va（Kou.）、D Va（Hus.）和D Va-like （YH.）各1例，D VI type Ⅲ表型7例。D Va（Kou.）和D Va-like （YH.）表型为国内首次报道。D杂合性分析发现，10例部分D表型均有RHD基因的缺失，即各部分D等位基因均为半合子。这和国外报道的弱D和部分D表型先证者的D杂合性结果一致［8］。
D Va表型包括了D Va（Kou.）、D Va（Hus.）、D Va（To.）、D Va（SM.）和D Va-like（YH.）5种亚型，其共同特点是Rh23抗原阳性，由部分或者全部RHD基因的外显子5被RHCE基因相应部分替换引起，都有233 Glu>Gln的氨基酸替换，该突变位于RhD蛋白中对表位表达很重要的第4胞外环，从而影响D抗原表位的完整性。
在日本西部大阪地区检测到的部分D中有44％是D Va［9］，我们的结果中D Va占了部分D的30％，其中D Va（Kou.）表型只有223 Phe>Val和233 Glu>Gln氨基酸的替换。223 Val位于RhD蛋白的跨膜区域，可能影响D抗原量的表达。D Va（Hus.）表型和D Va-like （YH.）表型分别携带外显子5的8个和6个核苷酸突变，其中744 C>T为沉默突变。这2种部分D都有位于RhD蛋白第7和第8跨膜区域的223 Phe>Val和245 Val>Leu替换，可能是这两个表型D抗原密度下降的原因所在。位于RhD蛋白的第4胞外环的226 Ala>Pro、233 Glu>Gln和238 Val>Met替换可能影响D抗原表位的完整性。但是D Va（Hus.）比D Va-like （YH.）多了2个位于胞内环的263 Gly>Arg和267 Lys>Met 替换，这是这2个表型分子水平的区别。
本研究用于特异扩增RHD外显子5的PCR-SSP上游引物位于RHD内含子4的区域，扩增产物中检测到D Va（Hus.）的RHD外显子5的7个特异性氨基酸都被RHCE特异的氨基酸替换，这和Shao等［10］认为D Va（Hus.）的整个RHD外显子5和内含子5都被RHCE基因相应部分替换的结果一致。
国外对D VI的研究比较深入，已经确认D VI表型都是RHD和RHCE基因转换引起，并非RHD外显子的缺失［7，11］。我们检测到的7例部分D的外显子3-6的PCR-SSP反应呈阴性，根据Legler和Wagner等报道的PCR-SSP反应格局，我们判断该7例部分D为D VI type Ⅲ，并且7例D VI type Ⅲ的单倍体型为CDVIe，和国外报道一致。
香港特区弱D表型约占随机人群的0.016％［12］。在日本西部（大阪）部分D表型约占人群的0.0007％，日本东北部部分D表型约占0.0067％，有显著性差异［9］。D VI type Ⅲ是欧洲人中临床意义最大的部分D表型，约占英国人群的0.04％，德国人群的0.02％，而荷兰人群中的比例大于德国的3倍之多，各地分布有显著性差异［1］。我们的数据表明，如果按照Rh阴性在随机人群中的比率为0.4％，浙江地区弱D表型约占随机人群的0.0069％，D Va表型约占随机人群的0.00094％，D VI type Ⅲ在随机人群中约占0.0022％，部分D表型在随机人群中约占0.0031％。浙江人群弱D表型和D VI type Ⅲ表型的频率均分别低于中国香港、德国等地的相应人群频率。但是部分D表型在浙江人群中的频率介于日本的西部（大阪）和东北部的部分D表型的人群频率之间。可见弱D和部分D在随机人群中的频率因地区或者人种不同有较大的差异。
除了DNB等因D抗原密度没有明显下降而和抗D在盐水中反应呈阳性的部分D表型外，大部分部分D表型在D表位缺失的同时还伴随着D抗原密度的下降，在IAT实验中呈阳性结果［1］。因此，虽然弱D和部分D血清学的定义并不相同，临床上检测到的弱D常包括部分D［7］。当鉴定部分D的单克隆抗体缺乏或者是极弱表达的D抗原（不能用单克隆抗体鉴定表位）时，从基因水平鉴定弱D样本，从而鉴定出部分D表型也是一个很有效的研究部分D的策略。本研究鉴定了10例部分D的分子机理，并推算了相关的人群频率数据，对促进针对D变异体的基因分型策略的完善、指导临床输血工作和育龄妇女的抗D免疫预防、RHD基因的进化、变异和D蛋白的生物学功能等研究有重要的意义。
【】
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