FLT3靶向短发夹状干扰RNA体外转录合成及作用
作者：卢洁，盛光耀，邹湘，方营旗，赵晓明，徐学聚，白松婷，许培荣，王建人
【摘要】 FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)是一种酪氨酸激酶受体，在大多数急性髓系白血病(AML)患者中持续激活，与患者预后差密切相关。为探讨3种FLT3靶向短发夹状干扰RNA(shRNA)对急性髓系白血病细胞株THP?1的沉默效应，设计和体外转录合成3个FLT3靶向shRNA (shRNA1、shRNA2、shRNA3),体外转染THP?1细胞;以RT?PCR法检测FLT3 mRNA水平表达，用流式细胞术、免疫荧光测定法检测FLT3蛋白的表达。结果显示：shRNA1、shRNA3可显著下调FLT3 mRNA的表达，其中shRNA1的抑制作用较强。25 nmol/L shRNA1转染48小时对FLT3 mRNA的抑制率是(72.95±2.07)%，作用可达72小时。5 nmol/L及以上浓度的shRNA1对FLT3 mRNA表达有下调作用，作用存在量?效关系。15 nmol/L shRNA1的抑制率是(67.53±0.66)%。FLT3蛋白位于细胞膜上，shRNA1对其有较强的抑制作用，转染72小时蛋白抑制率达(79.67±0.66)%。结论：FLT3?shRNA1具有较好的FLT3基因靶向抑制作用，可作为进一步研究该基因作用机制及靶向可能性的工具。
【关键词】 急性髓系白血病
In Vitro Transcription Synthesis and Effects of FLT3 Targeted Short Hairpin RNA
Abstract FMS?like tyrosine kinase 3 (FLT3) is a receptor of tyrosine kinase that is constitutively activated in most of acute myeloid leukemia patients and seems to give an adverse prognosis. In order to explore the silencing effect of FLT3 targeted short hairpin RNA (FLT3?shRNA) on acute leukaemia cell line THP?1, three FLT3?shRNAs (shRNA1, shRNA2, shRNA3) were designed and synthesized by transcription system in vitro and then transfected into THP?1 cells. FLT3 mRNA was analyzed by semi?quantitative RT?PCR, FLT3 protein was detected by Flow cytometry and immunofluorescence. The results indicated that FLT3 expression was downregulated by shRNA1 and shRNA3, and shRNA1 showed stronger inhibitory effect. At 48 hours following transfection, the inhibitory rate of 25 nmol/L shRNA1 was 72.95±2.07%, lasting 72 hours. The 5 nmol/L and more concentration of FLT3 shRNA1 could downregulate FLT3 mRNA level, which displayed a quantity?effect relation; the inhibitory rate of 15 nmol/L shRNA1 was 67.53±0.66%. FLT3 protein was located on THP?1 cell membrance, its expression was downregulated obviously by shRNA1，at 72 hours following transfection the inhibitory rate of shRNA1 was 79.67±0.66%. shRNA1 showed the best inhibitory effect on FLT3 protein, the optimal time of which was 72 hours with an inhibitory rate of 79.67%. It is concluded that FLT3?shRNA1 shows a desireable FLT3?targeted inhibitory effect, which can be used for further investigation of FLT3 mechanism or FLT3 targeting treatment.
Key words acute myeloid leukaemia；FLT3；FLT3?shRNA; RNA interfering；THP?1 cell line
FMS样酪氨酸激酶3(FMS?like tyrosine kinase 3，FLT3)是Ⅲ型受体酪氨酸激酶(RTK)受体家族的成员，与急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)关系密切［1,2］。大多数AML细胞表面有FLT3的过表达，而FLT3是AML最常见的单基因突变，约17%-30%的患者有FLT3近膜区串联重复突变(FLT3?ITD)，1.6%-7.0%患者有酪氨酸激酶结构域点突变(FLT3?TKD)，这和患者临床高白细胞血征、缓解率低、预后差密切相关。FLT3被认为是AML极有前景的治疗靶点，其靶向抑制深受关注［3,4］。 然而FLT3 与其它 Ⅲ 型 RTK 受体同源性高，往往不易获得高选择性抑制剂［5］，且据白血病发生“二次打击模型”表明，AML发生需要两种基因突变的累加，其中之一突变使细胞具增殖和存活优势，之二突变干扰了造血分化和之后的细胞凋亡［6］，FLT3抑制研究也需要与其它靶向抑制协同，所以有必要对FLT3抑制方式和方法进一步探讨。本研究采用体外转录的方法，合成3个FLT3靶向的短发夹状干扰RNA（FLT3?small hairpain interfering RNA,FLT3?shRNA）,体外转染FLT3过表达的AML细胞株THP?1，从FLT3的mRNA、蛋白水平评定其干扰效应，以筛选出一条效率高的FLT3干扰靶序列，用于FLT3?RNAi质粒载体构建及后续研究。
材料
THP?1细胞株购自院上海细胞研究所,T7 RiboMAXTM Express RNAi System及CodeBreakerTM siRNA Transfection Reagent购自Promerga公司，FLT3?shRNA的Oligo单链DNA模板、测定引物由上海鼎安合成，TRIzoL购自Invitrogen公司，AMV?cDNA第一链合成试剂盒购自上海生工生物工程公司，rTaq聚合酶，dNTP等购自TaKaRa公司，鼠抗人单克隆抗体Flt?3/Flk?2、山羊抗鼠IgG1?FITC购自Santa Cruz公司。
细胞培养
THP?1培养于含15%胎牛血清、10 mmol/L HEPES、1.0 mmol/L 丙酮酸钠、0.05 mol/L 2?巯基乙醇、100 U/ml青霉素及链霉素的DMEM中，置于37℃、5% CO2培养箱。实验细胞均处于增殖指数期。
FLT3?shRNA的设计及合成
人源FLT3 mRNA基因在GenBank登录号是NM?004119，全长3 475 bp，在其读码框58-3 039 bp内，用TaKaRa公司提供siRNA软件设计并同源比对，择定3条靶mRNA干扰序列（附表）。
Table 1. Targeting interference sequences of mRNA
Targeting sequence
on mRNA (5′→3′) Location
(NM004119)shRNA1GCTGTTCATGTGAACCATG877-895shRNA2GGAGTCTGGAATAGAAAGG1 498-1516shRNA3GAAACGACACCGGATACTA1 022-1040
同时合成3种FLT3?shRNA及无关序列的阴性对照shRNA(negative control? shRNA,NC?shRNA)。步骤：①化学合成Oligo单链DNA模板，退火后形成模板双链,模板终浓度是10 pmol/μl。②建立20 μl反应体系，包括 RiboMAX ExpressT7 2×缓冲液10 μl、退火DNA Oligo模板2 μl、无RNase水6 μl、Enzyme Mix 2 μl；于37℃孵育30分钟后加入1 μl的RQ1无核酶DNase,37℃孵育30分钟，进行生成shRNA纯化，用60 μl无核酶水溶解。③用2.5%琼脂糖凝胶电泳定量。以1 μl退水双链DNA模板作对照，取1 μl shRNA产物上样，根据吸收峰面积、模板浓度、shRNA和模板分子量shRNA浓度。生成shRNA49 bp，其序列为:FLT3?shRNA1：5′?GC UGUUCAUGUGAACCAUGucucuugaaCAUGGUUCA CAUGAACAGCUU?3′；FLT3?shRNA2：5′?GGAGU CUGGAAUAGAAAGGucucuugaaCCUUUCUAUUCC AGACUCCUU?3′；FLT3?shRNA3：5′?GAAACGAC ACCGGAUACUAucucuugaaUAGUAUCCGGUGUCG UUUCUU?3′；NC?shRNA：5′?UUCUCCGAACGUGUCA CGUucucuugaaACGUGACACGUUCGGAGAAUU?3′。
转染
设同代培养正常细胞对照组、NC?shRNA组对照组及实验组，转NC?siRNA/FITC以确定转染效率。细胞离心后用全培养液调至4×105/ml，取2.5 ml接种于6孔板中。先将无血清培养液625 μl、转染试剂7 μl充分混合，室温静置20分钟；再按既定量滴加shRNA，室温静置20分钟；后逐滴加入培养板/瓶的中心部位，前后左右震荡混匀,放回培养箱，按既定时间收获细胞。
mRNA表达的半定量RT?PCR检测
按TRIzoL常规提取细胞总RNA并反转合成cDNA第1链；以GAPDH作内参对照，用RT?PCR检测FLT3 mRNA表达。引物FLT3: P1 5′?TCAAGTGC TGTGCATACAATTCCC?3′； P2 5′CACCTGTAC CATCTGTAGCTGGCT?3′。GAPDH:P1 5′?GCAC CGTCAAGGCTGAGAA?3′；P2 5′?AGGTCCACCA CTGACACGTTG?3′。FLT3产物长210 bp；GAPDH长570 bp。反应体系25 μl：ddH2O 19.375 μl、10×buffer 2.5 μl、dNTP2.0 μl、rTaq聚合酶0.125 μl、上下游引物各0.25 μl(浓度100 ul/ml)、模板cDNA 0.5μl。反应条件：94℃预变性3分钟；95℃ 30秒，56℃退火30秒,72℃延伸40秒,共30个循环,最后72℃延伸5分钟，4℃中止。用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析RT?PCR扩增产物，根据吸收峰面积计算FLT3?mRNA相对含量(RC)，RC=FLT3吸收峰面积/内参吸收峰面积。先用终浓度25 nmol/L的shRNA转染细胞，评定3种shRNA转染24、48及72小时时的干扰效率；后以筛出的shRNA1以5、10、15、20、25 nmol/L梯度转染细胞，收集48小时的细胞，筛选最佳作用浓度。
FLT3蛋白表达的FCM检测
以15 nmol/L shRNA1转染，48、72小时时收获细胞，经鼠抗人单克隆抗体Flt3、鼠抗IgG1?FITC分别作用，用PBS洗涤后上FCM测细胞FLT3蛋白表达，以PBS代替一抗作阴性对照。上FCM检机检测1×104个细胞，CellQuest软件分析。实验独立复行3次
FLT3蛋白亚细胞定位及表达的免疫荧光检测
以15 nmol/L shRNA1转染并收获72小时细胞，浓缩后作单层细胞涂片,晾干，用4%多聚甲醛固定，用PBS淋洗后兔血清封闭；倾去血清，用1∶200稀释FLT3一抗覆盖细胞层，于4℃在湿盒中过夜；次日PBS淋洗后加1∶400稀释IG1?FITC二抗，冰上避光孵育40分钟，PBS淋洗，荧光显微镜观察，同时以PBS代替一抗作阴性对照。实验独立复行3次。
统计学处理
FLT3?mRNA相对含量(M)=FLT3吸收峰面积/内参吸收峰面积，抑制率%=(阴性对照M值-干扰后M值)/ 阴性对照M值×100；采用单因素方差分析或独立样本资料t检验，在SPSS 13.0上完成。
结 果
NC?shRNA及3种FLT3?shRNA合成及浓度确定
以T7启动子介导体外转录合成的NC?shRNA及3条FLT3?shRNA均49 bp，无降解、无弥散，各泳道DNA模板去除完全。以上样量1 μl的 DNA Oligo模板(分子量43 750.05 Da、浓度为10 μmol/L)吸光率峰值为1，则泳道1、泳道2、泳道3、泳道5分别为1.01、0.94、0.46、0.76，由此出NC?shRNA、shRNA1、shRNA2、shRNA3（分子量15 028.0 Da）的浓度分别为29.43、27.43、13.40、22.14 μmol/L(图1)。
siRNA转染效率
将FITC标记的NC?siRNA同条件转染，24小时时以荧光显微镜观察，其转染THP?1细胞的效率可达90%以上(图2)。
Figure 1. Analysis of different shRNA molecules generated by the T7 RiboMAXTM Express RNAi System and electrophoresis on agarose gel. Lane 1:NC?shRNA. Lane 2:shRNA1. Lane 3:shRNA2. Lane 4:shRNA3. Lane 5:DNA Template. Lane 6:100 bp DNA ladder.
Figure 2. Transfection efficiency of NC?siRNA/FITC in THP?1 cells.
3种FLT3?shRNA干扰后FLT3 mRNA的表达
在24、48、72小时时不同处理组间FLT3 mRNA的相对含量有差异，F24 h=20.034、F48 h=33.912、F72 h=17.882， p＜0.001；3个时间点正常对照组与NC组相对含量无差异；shRNA2组在24、48小时与对照组无差异，72小时低于对照组（p＜0.02），而shRNA1、shRNA3与对照组相比在各时间点均有显著下降，shRNA1下降幅度明显大于shRNA3（p＜0.001）,shRNA1最大抑制率是（72.95±2.07）%(图3)。
不同浓度shRNA1干扰后FLT3 mRNA的表达
不同浓度处理组间FLT3 mRNA的相对含量有差异（F=38.857，p＜0.001）。正常组与NC组的FLT3 mRNA相对含量无差异（p＞0.05）；与对照组比5浓度组FLT3 mRNA均有下降（p＜0.05），统计学不支持5 nmol/L与10 nmol/L间，15、20 nmol/L与25 nmol/L之间作用有差异，而后3组mRNA相对含量显著低于前2组（p＜0.001），15 nmol/L浓度作用抑制率可达（67.53±0.66）%（图4）。
FLT3?shRNA1、FLT3?shRNA3干扰后FLT3 蛋白表达
48、72小时不同处理组间THP?1细胞表面FLT3蛋白表达率有差异（F48 h=59.763、F72 h=161.192， p＜0.001）；这两个时间点正常对照组与NC对照组表达无差异，但shRNA1、shRNA3组均明显低于对照组，且shRNA1下降明显大于shRNA3（p＜0.001）；shRNA1作用72小时FLT3蛋白表达低于48小时时，p＜0.05，72小时时shRNA1蛋白抑制率可达（79.67±0.66）%（图5）。
讨 论
RNA干扰是对哺乳动物进行遗传分析的一种重要工具，除高效性、稳定性、可遗传性外，还具有特异性和靶向性。RNAi只干扰FLT3信号传导，对其它RTK信号无影响；而不同靶向RNAi能够同时抑制多个不同基因，且抑制效果互不干扰，这对AML这种多基因疾病研究有其独特的优势［7,8］。人FLT3基因位于13q12, mRNA全长3475 bp，读码框于58-3 039 bp内，共有24个外显子，编码的FLT3受体为含993个氨基酸的跨膜分子，胞外区5个IgG样结构是FLT3配体结合域、跨膜区是激酶不连续作用域，胞内区2个分开的激酶结构域是酪氨酸激酶的催化区域［2,9］。干扰RNA设计依据Harborth原则，作用区均长19 bp，GC含量为47%，序列中不含有连续4个或多于4个的T结构，二级结构无成茎和成袢现象。有报道提示，5′端第1个碱基为G/C，3′端碱基为G/C，3′端5 bp碱基富含有A/U区的siRNA最为有效［10,11］，shRNA1、shRNA2的干扰序列均以G开始和结尾，3′端5个碱基A/U占2个及以上；经NCBI同源比对3个shRNA均不存同源靶点。
以T7 RiboMAXTM Express RNAi System体外转录合成shRNA效率较高，合成NC?shRNA、shRNA1、shRNA2、shRNA3的1个反应、终产物以60 μl无核酸酶水溶解，其浓度分别为11.94、15.72、11.64、17.47 μmol/L。用Promerga公司siRNA transfection reagent转染，经同条件转染FITC标记的NC?siRNA验证，转染THP?1细胞的效率可达90%以上。
我们先用终浓度25 nmol/L的shRNA1、shRNA2、shRNA3转染细胞，据报道该浓度shRNA可达其最大干扰效率，半定量RT?PCR证实了shRNA1、shRNA3可显著下调FLT3 mRNA的表达，且在24、48、72小时shRNA1对FLT3 mRNA均有很强的抑制作用,但最强抑制时间是48小时，作用可达72小时，最大抑制率为（72.95±2.07）%。再者5 nmol/L及以上浓度的shRNA1对其mRNA表达有下调作用，作用存在量?效关系，15 nmol/L shRNA1的抑制率为(67.53±0.66)%。
免疫荧光结果显示，FLT3蛋白位于细胞膜上；FCM检测显示，shRNA1有较强的FLT3蛋白抑制作用，其作用较强时间点在72小时,蛋白抑制率达(79.67±0.66)%，免疫荧光检测也显示，shRNA1转染72小时细胞膜上FLT3的荧光强度明显下降。综上所述，在设计的3条FT3?shRNA中，以shRNA1具有最强的FLT3靶向抑制作用，且经多次实验证实其作用稳定、重复性好，可作为进一步研究该基因机制及靶向可能性的工具，其mRNA靶标也可作为今后构建FLT3?RNAi质粒载体的靶序列。
致谢：本课题在河南省分子医学重点实验室完成，特此致谢！
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