重组腺伴随病毒载体介导Kringle5基因对SD大鼠视网膜神经细胞及血管内皮细胞的影响
作者：宋哲 黎晓新 于文贞 董建强 闫征
【摘要】 目的：研究腺伴随病毒载体介导Kringle5基因对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUC)及视网膜神经细胞影响作用。方法：亚克隆构建pSNAV-Kringle5-gfp载体，腺伴随病毒包装形成rAAV-Kringle5-gfp；HUC培养及SD大鼠视网膜神经细胞培养；按设计分为试验组、阴性对照组和空白对照组；聚合酶链反应(PCR), MTT法对各组进行细胞活力测定；荧光显微镜照相。 结果：腺伴随病毒载体介导Kringle5基因产生Kringle5物质对HUC有抑制作用，实验组与对照组比较P <0.01，实验组与空白对照组比较P >0.05；腺伴随病毒载体介导Kringle5基因产生Kringle5物质对SD大鼠视网膜神经细胞实验组和空白对照组没有影响，实验组与对照组及实验组与空白对照组比较P >0.05。结论：腺伴随病毒载体介导Kringle5基因能够对新生血管有抑制作用而对视网膜神经细胞无不良影响作用。
【关键词】 腺伴随病毒载体 血管抑制素Kringle5 血管内皮细胞 SD大鼠视网膜神经细胞
Adeno-associated virus type-2 expression of Kringle5 effect on HUC and Retinal cell of SD rat
AbstractAIM: To investigate the effect of recombinant adeno-associated virus vector expressing human Kringle5 on the HUC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells) and the retina nerve cell of SD rats. METHODS: The human kringle5 cDNA was plugged into expression vector of pSNAV to construct the plasmid pSNAV-Kringle5-gfp. HUC and the retina nerve cell of SD rats were cultured. All the samples were devided into three groups: experimental group, negative control group and blank control group. Polymerase chain reaction (PCR), MTT assay and fluorescence microscopy were applied.RESULTS: rAAV-Kringle5 produced kringle5, which inhibits the HUC (P <0.01 between experimental group and controls; P>0.05 between experimental group and blank control) but has no effect on the retinal nerve cell of rats (P <0.01 between experimental group and controls; P <0.05 between experimental group and blank control).· CONCLUSION: The method of producing kringle5 by recombinant adeno-associated virus can be used to inhibit retina angiogenesis with no effect on retinal nerve cells.
· KEYWORDS: adeno-associated virus vector; Kringle5; HUC; retinal nerve cells
0引言
纤维溶酶原Kringle5片断能够抑制肿瘤的生长，对新生血管形成具有极强抑制作用，是目前发现抑制新生血管作用最强的抑制剂[1]。在眼科方面，国内外曾报道用Kringle5制剂新生血管如脉络膜新生血管，视网膜新生血管，角膜新生血管等报道[2-4]。Kringle5是纤维溶酶原片段,由80个氨基酸组成[1,5]，它的获得主要是通过提取纤维溶酶原裂解获得,但是获取量有限且工艺复杂。理想的方案是利用基因重组技术将其在生物体内长期表达达到治疗新生血管目的。2型腺伴随病毒具有对人体不致病，能感染分裂和非分裂期细胞等优点，在此基础上改建得到的重组腺伴随病毒载体是较理想的基因转移载体[6]。在本实验中，我们利用腺伴随病毒载体介导Kringle5基因,观察其对视网膜神经细胞和血管内皮细胞是否有作用，为下一步动物实验提供实验依据。
1材料和方法
1.1材料 含Kringle5基因的质粒pSECTAG- Kringle5由北京大学人民眼科中心提供；腺伴随病毒载体pSNAV购自本元正阳基因公司，为带有腺相关病毒末端反向重复序列的真核表达载体，含CMV启动子、AMP抗性及G418抗性并含有KpnI和XbaI等多克隆位点及GFP基因；限制性内切酶；T4DNA连接酶；M-MLV逆转录酶购自华美公司；HUC购自预防院病毒所；DMEM培养基购自Gibco公司；SD大鼠视网膜神经细胞由新生SD幼鼠视网膜经过消化所得。
1.2方法 pSNAV-Kringle5 重组腺伴随病毒载体构建和鉴定：Kringle5及其信号肽由pSECTAG-Kringle5载体克隆至pSNAV形成pSNAV-Kringle5。根据pSECTAG-Kringle5[7]载体设计上游和下游引物Primer1:5’-ATTCGGTACCAAGCTTGGAAGAAGACTGTATG.;Primer2:5’-CGACGAATTCTCTAGAAGGGGCCGCAC.在两条引物中分别加入KpnI和XbaI限制内切酶位点。PCR产物回收纯化后，并且和T载体连接，转化后用AMP进行筛选KpnI和XbaI 酶切，回收片段，同样消化pSNAV并回收载体，连接，转化，挑选克隆并用KpnI和XbaI酶切鉴定，测序鉴定，命名为pSNAV-Kringle5。腺伴随病毒包装由本元正阳基因公司完成。腺相关病毒转染效率实验:将生长至融合期脐静脉血管内皮细胞消化，按照预先设计每个培养皿细胞数105 个，50mL/L CO2孵箱中培养24h后换液，根据MOI=50加入5×106v.g rAAV- Kringle5及含有100g/L胎牛血清高糖DMEM培养基继续培养48h后，在荧光显微镜下观察荧光强度。血管内皮细胞及视网膜神经细胞抑制实验[8]（MTT法）：取两个96孔培养板分别加血管内皮细胞和视网膜神经细胞.，每孔加入细胞数约为105个,加培养液至200μL，将其放至50mL/L CO2孵箱中培养24h时细胞融合时换液。按设计MOI=50,实验组每孔加入rAAV-Kringle5病毒颗粒约 5×106 个，阴性对照组加入rAAV-null病毒颗粒约5×106个，空白对照组加营养液继续培养48h,加MTT 20μL，4h后加DMSO 200μL，震荡5min，用570nm测定A 值。
2结果
2.1重组质粒的构建和鉴定 PCR产物片段约300bp,大小约为目的基因及信号态基因之和。经测序和读码框校读为Kringle5基因，（图1）为构建好pSNAV-Kringle5 用KpnI和XbaI双酶切，300bp余片段。腺伴随病毒包装滴度为2.5×1015 v.g/L，滴度和纯度均达到实验要求。选用感染复数MOI=50，rAAV-Kringle5 -gfp,腺相关病毒感染血管内皮细胞：48h荧光显微镜下观察绿色荧光表达，荧光显微镜下可见所有细胞都有表达且高表达,感染率达100%(图2)。
图 1 构建好pSNAV-Kringle5用KpnI和XbaI双酶切下300余bp片段
图 2 rAAV-Kringle5在血管内皮细胞有较高表达（IF×100）
2.2视网膜神经上皮细胞各组 实验组平均值A nm=0.323,阴性对照组平均值A nm =0.345,空白对照组平均值A nm=0.310。经过实验组和阴性对照组间及空白对照组比较t检验P >0.05；根据存活率=实验组光密度值/空白对照组光密度值, 抑制率=1-存活率，计算由腺伴随病毒载体介导的Kringle5基因对视网膜神经细胞实验组、阴性对照组和空白对照组的抑制率大致为5.6%。血管内皮细胞各组：实验组平均值A nm=0.2286，阴性对照组平均值A nm =0.4016 空白对照组平均值A nm=0.430。实验组和对照组比较t检验P <0.01；阴性对照组和空白对照组比较t检验P >0.05，计算血管内皮细胞实验组存活率=53%，阴性对照组存活率=0.4061/0.430=94.4%。抑制率=1-存活率; 实验组血管内皮细胞抑制率=47%；阴性对照组及空白对照组血管内皮细胞抑制率约5.6%（表1）。
3讨论
pSECTAG-kringle5载体由人民眼科中心实验室构建，我们根据载体的信号肽序列设计引物，在引物中引入KpnI和XbaI 酶切位点，将 Kringle5基因及γ信号肽基因亚克隆至质粒pSNAV形成pSNAV-Kringle5经过测序证实了引入片段及读码正确性。将构建好的pSNAV- Kringle5质粒进行腺伴随病毒包装rAAV-Kringle5形成病毒颗粒，包装滴度为2.5×1015v.g/L，检测滴度和纯度均达到我们试验要求。将含有目的基因带GFP标记腺伴随病毒按MOI=50感染血管内皮细胞。根据在荧光显微镜下观察细胞，发现目的基因在血管内皮细胞有较高表达[9]。在实验中Kringle5基因表达产物作用血管内皮细胞48h，光学显微镜下观察发现血管内皮细胞稀疏，生长缓慢说明其对血管内皮细胞在增殖和移行方面都有抑制作用同Ji等[10]报道；对照组及空白对照组细胞生长较快，密度较高。观察Kringle5基因表达产物对视网膜神经细胞影响实验组，阴性对照组，空白组细胞密度没有变化。根据MTT法在神经细胞实验组、空白对照组、阴性对照组间比较t检验P >0.05,说明几组之间差异没有显著性。说明表达产物对视网膜神经细胞没有影响，这一结果和我们光镜下观察相一致。上述各组视网膜神经上皮细胞抑制率为5.6%，出现这一结果可能由于实验中细胞计数，视网膜神经细胞对培养液要求较高等多种因素所致。根据MTT法计算血管内皮细胞实验组、空白对照组、阴性对照组间比较t检验，血管内皮细胞实验组和对照组差及与空白对照组比较也有显著性（P <0.01），说明表达产物对血管内皮细胞有抑制作用，根据MTT法计算表达产物对血管内皮细胞抑制率为47%；我们在细胞水平检测由腺伴随病毒介导Kringle5基因对血管内皮细胞和视网膜神经细胞的作用，其对血管内皮细胞有抑制作用而对视网膜细胞的生长没有影响。在基因视网膜新生血管中，它不会影响视网膜生长和发育[11]。
【】
1 Cao YH. Kringle 5 of Plasminogen is a Novel Inhibitor of Endothelial Cell Growth. J Biol Chem ,1997;272:22924-22928
2 Murata M, Nakagawa M,Takahashi S. Inhibitory effects of plasiminogen fragment on experimentally induced neovascularization of rat corneas. Graefes Arch Cin Exp Ophthalmol ,1997;235:584-586
3 Drilxler TA , Rinkes IH,Ritchie ED. angiostatin inhibits pathological but not physiological retinal angiogenesis. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2001;42:3325-3330
4 Meneses PI, Hajjar KA, Berns KI. Recombinant angiostatin prevents retinal neovascularization in a murine proliferative retinopathy model. Gene ther ,2001;8:646-648
5 Cao Y, Ji RW kringle domains of human angionstatin characterization of the anti-poliferative activity on the endothelial cells. J Boil Chem ,1996;271:29461-29467
6吴小兵,董小岩,一种快速简便的重组AAV病毒的纯化方法.通报,2000;45:2071-2075
7奥斯伯.精编分子克隆生物实验指南.北京:科学出版社,1998:46-93
8司徒镇强,吴军正.细胞培养.第1版.西安:世界图书出版公司,1996:181-187
9 Zhao HS, Wang Y. Construction of relombinant adenoviral vector carrying the LEDGFp52 gene by homologous recombination in bacteria and its expression in vitro. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi) ,2006;6(5):979-983
10 Ji WR, Barrientos LG. selective inhibition by kringle5 of human plasminogen on endothelial cell Migration, an important process in angiogenesis. Biochem Bophys Res Commun,1998,247:414-419
11卢春光,胡丹,惠延年.腺病毒介导的脑源性神经营养因子基因在培养的雪旺细胞中的表达.国际眼科杂志,2006;6(2):361-364
