增生性玻璃体视网膜病变中组织型转谷氨酰胺酶的表达
作者：王辉 刘哲丽 郝旭红 徐丽
【摘要】 目的: 检测增生性玻璃体视网膜病变（PVR）视网膜前膜和视网膜色素上皮（RPE）细胞中组织型转谷氨酰胺酶(tTG)的表达情况，探讨tTG是否参与PVR的发病过程。方法: PVR患者21例,收集视网膜前膜，C级8例，D级13例, 行tTG免疫组织化学染色。另对培养3～5代的人RPE细胞分别用含有100mL/L PVR玻璃体液、正常玻璃体液和PBS的DMEM培养液进行孵育24h后行tTG免疫细胞化学染色。光镜下观察，比较C级和D级膜的表达阳性率，显微图像分析测量3组RPE细胞染色的平均灰度值。结果：在PVR视网膜前膜中tTG呈阳性表达（81％）， C级和D级膜表达阳性率无差异（C级88％，D级77％，P >0.05）。培养的人RPE细胞表达tTG，在PVR患者的玻璃体液作用下，tTG表达的平均灰度值为137.0±2.6，与正常玻璃体液组（143.5±2.9）及PBS对照组（143.6±3.0）相比，表达水平升高（P <0.05）。结论：PVR视网膜前膜和培养的人RPE细胞tTG表达阳性，在PVR患者的玻璃体液作用下，RPE细胞的tTG表达水平升高，这表明tTG参与了PVR的发病过程，在PVR视网膜前膜的形成过程中可能有重要作用。
【关键词】 增生性玻璃体视网膜病变 组织型转谷氨酰胺酶 视网膜色素上皮细胞
Tissue transglutaminase in proliferative vitreoretinopathy
Abstract AIM: To investigate the expression of tissue transglutaminase (tTG) in proliferative vitreoretinopathy (PVR) epiretinal membranes and retinal pigment epithelium (RPE) cells which is thought to be a key element in PVR formation. METHODS: Twenty-one samples of epiretinal membranes were obtained from patients with PVR involved previous rhegmatogenous retinal detachment. Eight samples were at C stage of PVR, 13 samples were at D stage. The samples were selected to perform immunohistochemical staining. Third- to fifth-passage human RPE cells were incubated by serum-free DMEM containing 100mL/L PVR vitreous samples, normal vitreous samples or PBS and stained immunocytochemically. Positive rates of expression were calculated in both C and D stage membranes under light microscopy. The staining average gray values of the three group RPE cells were detected with image analyzing system. RESULTS: The expression of tTG was present in PVR epiretinal membranes (80%). Positive staining was most prominent in ECM, fibroblast-like cells and macrophages. There was no significant difference in positive rates between C and D stage membranes (P >0.05). Cultured human RPE cells expressed tTG, and the expression level of RPE cells incubated with PVR vitreous samples was higher than those incubated with normal vitreous samples and PBS (P <0.05). CONCLUSION: The findings demonstrated that tTG is present in PVR epiretinal membranes and cultured human RPE cells. Its amount is stimulated to increase by the PVR vitreous humor. tTG takes part in the process of PVR. It may play an important role in the formation of PVR membranes.
· KEYWORDS:proliferative vitreoretinopathy; tissue transglutaminase; retinal pigment epithelium
0引言
增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）是孔源性视网膜脱离或视网膜脱离复位术后常见的并发症，是眼科中的难题之一，其具体的发病机制目前还不明确。PVR的病理过程主要包括视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞移行和增生，并分泌细胞外基质（extracellular matrix，ECM），ECM在局部沉积下来，为RPE细胞提供支架结构，同时进一步调控细胞的增生和分化，从而在玻璃体内和视网膜前和后表面形成广泛的纤维细胞增生膜，这些膜能收缩并牵拉视网膜引起复杂性视网膜脱离，导致视网膜结构和功能的破坏[1]。因此，RPE细胞的增生和ECM的沉积无疑是PVR发生过程中两个最为关键的环节。
近年来的研究表明，基质降解酶类如基质金属蛋白酶等在PVR增生膜的发展过程中释放增加[2]。这些酶的主要功能是降解ECM蛋白，防止过量的ECM沉积。不过尽管有这些降解酶存在，ECM仍持续积聚 [3]。因此，在此过程中一定同时存在稳定ECM使之不能被降解的因素，如果能找到这个因素并加以研究，可能会找到避免ECM沉积从而阻止PVR发展的方法。组织型转谷氨酰胺酶（tissue transglutaminase，tTG）又称转谷氨酰胺酶Ⅱ型（transglutaminaseⅡ，TGⅡ），属于转谷氨酰胺酶家族。它的主要功能是催化ECM成分之间形成共价交联，这种交联非常稳定，不能被任何已知的存在于脊椎动物体内的酶所降解[4]，因此PVR增生膜中ECM的持续积聚可能与tTG催化的这种交联反应有关。我们检测人PVR视网膜前膜和培养的人RPE细胞中tTG的表达情况，以及PVR患者的玻璃体液对RPE细胞的tTG表达水平的影响，探讨tTG是否在PVR的发病过程中发挥作用，以进一步明确PVR的发病机制，为寻找新的治疗方法提供依据。
1材料和方法
1.1材料 收集孔源性视网膜脱离合并PVR患者21例的视网膜前表面增生膜，C级8例，D级13例，多聚甲醛中固定，4℃冰箱冷藏备用。取死亡12h内，角膜移植术后的正常供体眼球6例，采用胰蛋白酶消化法获得人RPE细胞进行传代培养[5,6]，采用免疫细胞化学染色检测细胞角蛋白的方法对所用RPE细胞进行鉴定。抽取PVR患者的玻璃体液15例和角膜移植术后供体眼球的正常玻璃体液6例，1 000r/min离心8min，取上清液置于－70℃保存备用。鼠抗人tTG mAb和免疫组化超敏SP试剂盒等购自福州迈新生物技术开发公司。
1.2方法 PVR视网膜前膜固定后常规制作石蜡切片，先行HE染色，结构完整者行免疫组织化学染色。培养3～5代的人RPE细胞接种于盖玻片表面并平均分为3组，分别用含有100mL/L PVR玻璃体液、正常玻璃体液和PBS的DMEM培养液培养3组细胞，固定后行免疫细胞化学染色。光镜下观察tTG的表达和分布，以背景清晰、细胞内出现棕黄色着色为阳性。C级和D级膜的表达阳性率，并采用MetaMorph/DP10/BX41显微图像分析系统测量3组RPE细胞片染色的平均灰度值。
统计学处理：采用χ2检验比较C级和D级膜表达tTG的阳性率，单因素方差分析比较3组不同培养条件的RPE细胞中tTG表达的平均灰度值，P <0.05被认为差别有统计学意义。所有统计学分析均使用SPSS12.0统计软件来完成。
2结果
2.1 PVR视网膜前膜 结构完整的前膜中可见数量不等的RPE细胞、成纤维细胞样细胞、神经胶质细胞、巨噬细胞、淋巴细胞，排列不规则，还可见到胶原纤维等细胞外基质成分。C级膜中，细胞成分较多，细胞外基质相对较少，D级膜则相反。tTG的棕黄色阳性表达存在于细胞外基质和一些细胞的胞质。在细胞外基质中，阳性染色呈不规则灶性分布。阳性细胞主要为成纤维细胞样细胞和巨噬细胞，呈散在或聚集分布（图1A，B）。自身阴性对照组均未见阳性染色。8例C级膜中7例染色阳性（88％），13例D级膜中10例染色阳性（77％），行χ2检验，由Fisher确切检验法得P =1.00，故二组阳性表达率无统计学差异。
2.2培养的人RPE细胞 第3代以后的RPE细胞内色素颗粒明显减少至消失，细胞形状近似于成纤维细胞样。tTG阳性表达的RPE细胞表现为细胞质中浓淡不一的棕黄色染色。PBS对照组和正常玻璃体液组中可见散在细胞呈tTG阳性表达（图2A，B）；PVR玻璃体液组中阳性细胞明显增多，且染色呈浓密的深棕色，染色阴性的细胞少见（图2C）。不加第一抗体的自身阴性对照组中细胞均无着色。PVR玻璃体液组tTG表达的平均灰度值为137.0±2.6，正常玻璃体液组tTG表达的平均灰度值为143.5±2.9，PBS对照组tTG表达的平均灰度值为143.6±3.0。对三组结果进行单因素方差分析，F＝31.91，P <0.05，各组均数之间有显著性差异。进一步行各组结果之间的两两比较，PVR玻璃体液组tTG的表达水平高于正常玻璃体液组和PBS对照组，差别有统计学意义（P <0.05）；正常玻璃体液组与PBS对照组的表达水平无统计学差异（P >0.05）。
图 1 PVR视网膜前膜tTG表达（SP×400）A：C级；B：D级
图 2 培养的RPE细胞的tTG染色（SP×400）A：PBS对照组；B：正常玻璃体液组；C：PVR玻璃体液组
3讨论
转谷氨酰胺酶家族是一类能催化蛋白质谷氨酰胺残基与赖氨酸残基发生交联反应的钙依赖蛋白酶，包括角化细胞转谷氨酰胺酶、组织型转谷氨酰胺酶、表皮细胞转谷氨酰胺酶和凝血因子ⅩⅢa等[7]。组织型转谷氨酰胺酶即tTG是这个家族中分布最为广泛的成员，它在许多组织细胞的生理和病理过程中发挥多种功能，如参与细胞外基质的修饰、细胞粘附、细胞凋亡、细胞与细胞外基质的交互作用、信号转导等[8]。这些功能是通过催化纤维连接蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白和Ⅲ型胶原等发生共价交联，形成ε-（γ-谷氨酰）赖氨酸异肽键来实现的[7]，而研究表明这些蛋白恰好是构成PVR增生膜中ECM的主要成分[9]。由tTG催化形成的这种异肽键非常稳定，具有抗酶、化学和机械破坏的特性，能抵抗任何已知存在于脊椎动物体内的酶的作用[4]，所以胶原酶和其它基质降解酶均不能使之降解。我们在PVR视网膜前膜中检测到了tTG蛋白的表达。Priglinger等[10]在PVR增生膜中也检测到了tTG的活性，与我们的研究结果类似。而Raghunath等[11]采用免疫组化方法对正常成人视网膜组织进行的检测则未见tTG的阳性表达。这些提示我们tTG极可能与PVR的发病过程密切相关，也可能为PVR增生膜中基质降解酶的升高和ECM成分的持续累积之间的矛盾现象提供解释。我们检测到C级和D级PVR视网膜前膜中均有tTG蛋白的阳性表达，并且二者的表达阳性率没有差异，这说明tTG可能在PVR的不同临床阶段中均发挥作用。在PVR视网膜前膜的免疫组化染色切片中，我们发现tTG的阳性表达不仅存在于细胞外基质中，在一些成纤维细胞样细胞和巨噬细胞中也存在，这提示我们这些细胞可能是膜中tTG的来源之一。
RPE细胞作为PVR发病和增生膜形成过程中最为关键的细胞成分，是否能表达tTG蛋白？当它处于病理条件下时，表达水平是否会发生变化？为进一步解决这二个问题，我们检测了培养的人RPE中tTG的表达情况，并进行了半定量分析，发现未受到玻璃体液作用的RPE细胞即有tTG蛋白的表达，只是表达水平较低，当给予正常玻璃体液刺激时，表达水平没有明显变化，而给予PVR患者的玻璃体液刺激后，表达水平升高。因此，我们认为，培养的人RPE细胞能表达tTG蛋白，在PVR玻璃体液的作用下，表达水平增加。这提示我们PVR玻璃体液中可能含有刺激RPE细胞表达tTG的因素，而正常玻璃体液中没有这种因素或者含量较低。在PVR发病过程中，调控tTG表达的因素尚不清楚。研究表明，在培养的人RPE细胞、晶状体上皮细胞和小梁细胞中，转化生长因子β2（transforming growth factorβ2，TGF－β2）均能诱导tTG mRNA的合成[10,12,13]，而tTG则能促进TGF－β2由无活性形式向有活性转变，有活性的TGF－β2再以自分泌的方式进一步促进自身mRNA的合成[12]，由此形成一个恶性循环。在PVR患者的玻璃体液中，TGF－β2的活性增加[14]，我们的研究表明暴露于此环境中的RPE细胞表达tTG蛋白的水平也升高，因此我们推测：有活性TGF－β2的增加与tTG表达的增加可能互为因果。这种可能性进一步强调了tTG可能在PVR中扮演重要角色。
综上所述，PVR视网膜前膜和培养的人RPE细胞均表达tTG蛋白，PVR玻璃体液作用下的RPE细胞表达tTG的水平升高，这表明tTG参与了PVR的发病过程，并且在这个病理过程中，RPE细胞很可能具有合成tTG蛋白的能力，这种能力在细胞接触PVR患者的玻璃体液后被加强。本研究使我们对tTG与PVR的关系有了初步的了解，而对于tTG在PVR发病过程中发挥作用的确切机制、调控因素和对细胞因子的影响等还有待于进一步的研究。对tTG作用机制的深入研究和其特异性抑制剂的开发，可能会为我们临床防治PVR提供新的策略。
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