光明液对视网膜光损害模型大鼠的疗效观察

              作者：王萧，胡世兴, ，林少春，麦细焕，郭学军，邹移海

【摘要】  目的：探讨光明液对实验性视网膜光损害大鼠模型的作用。方法：SD大鼠32只随机分为4组：光明液组、模型组、正常组和VitE组。采用手术显微镜光源（Lux为30 000±50）照射SD大鼠右眼30 min，建立急性光损伤模型。分别采用光明液、VitE滴丸及等量蒸馏水进行灌胃治疗7d，观察细胞凋亡率、Caspase-3活力、NO含量变化及视网膜外核层厚度改变。结果：光明液可以明显降低视网膜细胞的凋亡率，有效地抑制细胞凋亡中的关键酶—Caspase-3蛋白酶的活力，还可一定程度减缓视网膜外核层厚度的改变，对具有细胞毒性和氧化作用的NO也有较强的降低作用。与抗氧化剂VitE相比，光明液的疗效要优于前者。结论：复方中药光明液是一种治疗视网膜光损害性疾病的有效的中药复方制剂。

【关键词】  视网膜 损害 细胞凋亡 光明液 中药

      0引言

    视网膜是人体重要的光感受器官，特别容易受到各种可见光或人工光源的损伤，高强度的光照射会导致视网膜的急性损伤。此概念早在柏拉图时代就已提出，但直到上世纪60年代，Noell等[1]才开始实验研究。1966年Noell曾报道，一定量的光，即使低于热损伤的阈值，也可引起小鼠的视网膜损伤。近年来，随着眼科光学诊疗器械和显微手术应用的增多，人们不仅对光，而且对各种器械的光源所导致的视网膜损伤等问题进行了深入的研究。另外，重复的光照射，即使强度较低，也可因光的蓄积作用而对视网膜产生损伤[2]，所以对视网膜光损伤的深入研究有着重要的临床和理论价值，但目前对此类疾病的治疗尚无理想的措施。为积极寻找能有效改善视网膜光损伤程度的、临床使用方便的、副作用较少的中成药注射液，我们利用显微手术的光源造成大鼠急性视网膜光损伤模型，来观察复方中药光明液对其的治疗作用，以期为对此类疾病的治疗寻找有效的防治方法。

    1材料和方法

    1.1材料  成年SD大鼠32只，雄性，体质量180～220 g，由广州中医药大学实验动物中心提供（粤检证字2003A028）随机分为4组：正常组，模型组，光明液组，维生素E组，每组8只。低温冷冻离心机（universal 16R型，美国Hettich Zentrifugen公司）；分光光度计（UV-1601型，日本shimadzu公司）； NO分析试剂盒（南京建成生物工程研究所）；流式细胞仪（美国Bekman Coulter公司Epics Elite型）。光明液（  党参15g、白术15g、茯苓20g、甘草8g、丹参30g、川芎30g）购于广州荔湾药材公司，煎取成1kg/L药液备用。VitE滴丸胶囊由广东中山市三才医药集团有限公司生产。光明液组及 VitE组均按成人临床用量（光明液4.5g/d；VitE 200mg/d）经折算后[3]的剂量进行灌胃治疗，其余两组灌等量蒸馏水，1次/d，7d为1个观察周期。到期后取材观察各项指标。

    1.2方法  大鼠10g/L戊巴比妥钠30mg/kg ip结合乙醚间断性吸入全麻[4]，复方托品酰胺充分散大右侧瞳孔，用苏州产YE-1型手术显微镜光源（150W，21V），光照度30 000±50Lux（光照度检测仪，上海），垂直照射大鼠瞳孔，照射时间为30min。在光照过程中，确保角膜完全暴露，不断滴生理盐水湿润眼球表面，工作温度保持在25℃左右。①Annexin V联合PI染色 视网膜组织剪碎后，加入PBS离心5min，然后加入2μL Annexin-V-fluorescein和100μL Hepes buffer，在25℃孵育15min，再离心5min后，弃上清加入2μL PI和100μL Hepes buffer，上流式细胞仪（美国Bekman Coulter公司Epics Elite型）检测。②Caspase-3活力测定 取视网膜后按试剂盒（Pharmingen产品，深圳晶美公司提供）要求进行，视网膜组织剪碎后，PBS清洗，置于冷的Cell Lysis Buffer中冰浴30min，然后加入AC-DEVD-AMC及HEPES BUFFER，37℃水浴1h后用日本Shimadzu公司RF-540型荧光分光光度计测定活力，激发波长为380nm，发射波长为420～460 nm。③NO的检测 脱颈椎法处死动物，迅速摘除眼球，在冰环境下剥离视网膜，以精密分析天平称视网膜湿重，再用双蒸水配成20g/L，匀浆。匀浆液3 000r/min离心15min，取上清液测NO含量按试剂盒操作说明，将NO转化为NO2-，显色法测定其含量。④视网膜外核层厚度测量 脱颈椎法处死动物，迅速摘除眼球，标本常规固定、脱水、包埋、修蜡，经视乳头颞侧旁开1mm纵向做5μm厚的切片，在显微镜下观察摄片，采用全自动图象分析系统（KONTRON IDAS公司2.0型，德国）测量外核层厚度。

    统计学处理：数据均以          表示，两组间均数差异采用t检验，SPSS统计软件协助处理。

    2结果

    我们采用流式细胞仪检测细胞凋亡率，光明液对大鼠光损伤模型细胞凋亡率的影响，见表1。光明液可降低Caspase-3蛋白酶的活力，光明液对大鼠光损伤模型Caspase-3活力的影响，见表2。经光明液、VitE治疗后，NO改变较为明显，光明液对大鼠光损伤模型NO影响，见表3。经过光明液和VitE治疗后外核层厚度变薄程度减缓，光明液对大鼠光损伤模型外核层厚度的影响，见表4。

    3讨论

    视网膜光损伤最早已有Noell等 [1]观察并报告。在不同条件下，视网膜的光损伤可有不同的表现类型。但一般来说，在光镜下的表现主要累及视网膜的光感受器细胞和色素上皮细胞[4,5]。我们利用手术显微镜的中等强度光源来制作大鼠光损害的模型，较逼真地模仿了临床实际。视网膜光损伤的成因一般包括如下3个方面，即热损伤、机械损伤和光化学损伤。据报道[6-8]，光照后6h就已出现眼内外节结构紊乱及淡染区，随后由于光感受器细胞的坏死而导致外核层、色素上皮细胞层细胞数减少，厚度变薄。光照后7d，由于坏死细胞大部分被吸收，外核层损害加重，表现为细胞核排列紊乱，部分消失及空泡出现，核层进一步变薄，仅留3～5层。所以外核层的厚度变化可以作为疗效观察的一个敏感指标。NO作为内皮细胞依赖性的调节物质，主要起着充当神经递质、增强机体非特异性免疫功能的作用，其毒性作用可能是细胞毒性作用，它可通过与超氧自由基的结合，分解出毒性更大的羟基自由基，从而对邻近细胞产生毒性作用。NO这个指标也可较精确地反映视网膜光损害后体内的变化情况[9,10]。最新的一些研究表明，由接受光照而引起的视网膜变性是一种细胞凋亡的改变，其机制很可能是由于致伤因子通过某些细胞凋亡基因的激活，从而导致细胞的变性、死亡。现在大多数理论认为细胞凋亡是受细胞内源性基因、酶类和信号传导途径调控的一个“瀑布式”激活过程，而Caspase家族是一切凋亡信号传导的共同通路，正由于此家族的激活最终导致内源性核酸酶的激活和细胞骨架重新组合所致的细胞结构解体，形成不可逆的凋亡。其中Caspase-3则由于其所具有的凋亡执行、承上启下的作用而成为Caspase家族中的核心成员，其活力的高低直接影响到视网膜细胞凋亡的进程[4,11]。

    光明液是一种缺血性视网膜疾病的验方，临床应用效果屡佳。该方主要由四君子汤加上川芎、丹参组成。脾胃之气健旺，运化正常，才能资生气血，气运血行。所以光明液以人参为主，甘温大补元气，健脾养胃；又配以苦温之白术为臣，健脾燥湿；茯苓甘淡渗湿健脾，与白术合用则健脾祛湿之功更强；配以川芎、丹参，活血行气、祛风安神，既补中有行，又使补而不滞；再加上炙甘草甘温补中，调和诸药。全方合用，共奏益气健脾、活血祛湿、行气祛风之效。药认为，四君子汤可有效提高机体的免疫力和活动机能，促进吞噬细胞的清除能力，对细胞膜的稳定性、特别是细胞核核膜的稳定性均有一定的加强作用。而丹参则因为其良好的活血化瘀和理气开窍的功效而对人体的自由基有着良好的清除作用。另有研究表明，丹参酮II-A磺酸钠和丹参素均可降低LPO含量，稳定生物膜，并可提高SOD活性，具有抗自由基作用。川芎的有效成份川芎嗪亦可抑制环核苷酸磷二脂酶活性，抑制血小板聚集，改善微循环，从而具有防止血栓形成和钙通道阻断剂作用。从以上研究可以看出，光明液可以减缓视网膜外核层变薄的程度，并且可以对抗由NO所引起的细胞毒性及抗氧化作用，降低视网膜细胞的凋亡率，抑制细胞凋亡途径中的关键酶——Caspase-3酶的活性，这一切都表明光明液此中药复方对视网膜光损害模型大鼠的治疗作用是通过保护细胞核层、抗氧化、抗细胞毒性和减缓细胞凋亡程度等多途径综合作用来实现的。VitE亦为临床常用的抗氧化剂之一，与Vit E的对照研究也从另一个侧面证实了光明液的疗效，但从各项指标结果来看，光明液的疗效要优于VitE滴丸。这为今后进一步研究此药治疗临床视网膜光损害性疾病奠定了良好基础，也为临床治疗此类疾病提供了一个有力的选择。

【文献】
  1 Noell WK, Organisciak DT, Darrow RM. Hyperthermia accelerates retinal light damage in Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1995;36(6):997-1007

2 Organisciak DT, Darrow RM, Barsalou L. Light history and age-related changes in retinal light damage. Invest Opthalmol Vis Sci ,1998;39:1107-1116

3徐叔云.药理实验方法学.北京:人民卫生出版社,1985:215

4 Tim Tl, Anderew SA, Mark OM. Apoptosis and Caspases after is chemia-reperfusion injure in rat retina. Invest Opthalmol Vis Sci ,1999;40(5):967-974

5 Rapp LM, Smith SC. Morphologic comparisons between rhodopsin-mediated and short-wavelength classes of retinal light damage. Invest Opthalmol Vis Sci ,1992;33:3367-3377

6胡世兴,王萧.缺血再灌注损伤诱导的大鼠视网膜细胞凋亡,中华眼底病杂志,2002;18(4):298-300

7丁建光,姜德咏,吴荣瀚,唐朝珍,李文生.兔视网膜不同缺血时间再灌注后ERG的变化.国际眼科杂志,2005;5(4):659-662

8牛膺筠,赵岩松,高云霞,周占宇,王红云.视网膜缺血再灌注损伤的机制及bFGF对其干预作用.国际眼科杂志,2003;3(3):27-31

9王萧,胡世兴.Caspase-3在急性视网膜光损伤模型中的作用.中山大学学报(医学版),2003;24(5):463-465

10王萧,胡世兴.光明液对大鼠缺血再灌注损伤模型的影响.中医眼科杂志,2003;13(1):5-8

11王萧,胡世兴.复方血栓通胶囊对光损伤模型大鼠的疗效观察.中华临床医药,2003;4(16):18-20