腺性膀胱炎及膀胱移行细胞癌中MMAC1的表达及意义

【摘要】  ［目的］ 研究MMAC1在腺性膀胱炎和膀胱移行细胞癌中的表达，探讨其与肿瘤发生、的关系。［方法］ 采用免疫组化方法测定20例腺性膀胱炎和40例膀胱移行细胞癌标本中的MMAC1蛋白的表达，以10例正常膀胱黏膜作为对照。［结果］正常膀胱黏膜中MMAC1的阳性表达率高于腺性膀胱炎和膀胱移行细胞癌，MMAC1表达缺失与膀胱移行细胞癌病理分级、临床分期明显相关。［结论］ MMAC1表达缺失可能与膀胱移行细胞癌的发生、发展有关，检测MMAC1的表达将有助于评估膀胱移行细胞癌的恶性程度及预后。

【关键词】  腺性膀胱炎 膀胱移行细胞癌 免疫组织化学 MMAC1蛋白

    The Expression and Significance of MMAC1 in Cystitis Glandularis and Bladder Transitional Cell Carcinoma

    CHEN Xiao-bo1, CHEN Jian2, TAN Jian-ming1

    (1.The First Affiliated Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080, China;

    2.The First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China)

    Abstract：［Purpose］To investigate the expression of mutated in multiple advanced cancer (MMAC1) in cystitis glandularis and bladder transitional cell carcinoma (BTCC), and to investigate the relationship between the expression of MMAC1 and the occurrence and development of BTCC. ［Methods］ Immunohistochemistry was used to detect the expression of MMAC1 in 20 cases with cystitis glandularis and 40 cases with BTCC, and 10 cases with normal bladder mucosa tissue were used as control. ［Results］ The positive rate of MMAC1 expression was much higher in normal bladder mucosa tissues than those in cystitis glandularis or BTCC. The MMAC1 negative expression was significantly correlated with grading and clinical staging BTCC. ［Conclusion］ MMAC1 negative expression might be related to occurrence and development in BTCC. To detect MMAC1 expression will contribute to the evaluation of the malignancy and prognosis for BTCC.  

    Key words: cystitis glandularis; bladder transitional cell carcinoma; immunohistochemistry; MMAC1 protein

    多种进展期肿瘤突变基因 (mutated in multiple advanced cancer 1，MMAC1)是至今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因[1]。研究证实MMAC1基因在多种人体正常组织中高表达，而在人体增殖细胞、良性肿瘤、癌中部分或完全失活。我们采用免疫组化方法对腺性膀胱炎和膀胱移行细胞癌(bladder transitional cell carcinoma，BTCC)中MMAC1蛋白的表达进行检测，以探讨其与BTCC发生、发展的关系及其临床意义。

    1   材料与方法

    1.1   一般资料

    标   本：采用广西医科大学第一附属2000年至2003年间病理活检及开放手术切除的标本，腺性膀胱炎20例，BTCC 40例，BTCC中男性33例，女性7例；年龄34岁~77岁；肿瘤单发22例 ，多发18例；初发27例，复发13例。BTCC病理分级按WHO标准：Ⅰ级19例，Ⅱ级13例，Ⅲ级8例 。临床分期按UICC?鄄TNM标准：Tis~T1 25例，T2~T4 15例；N0 38例，N1 1例，N2 1例，N3~4 0例；M0 39例，M1 1例。10例对照者为前列腺手术时取得的正常膀胱黏膜组织。标本均经病理证实，福尔马林(10%甲醛溶液)固定，石蜡包埋。

    试剂：鼠抗人MMAC1即用型单克隆抗体，SP免疫组化试剂盒，柠檬酸抗原修复缓冲液，PBS磷酸盐缓冲液，DAB显色液 (均购于福州迈新生物技术开发有限公司)。

    1.2   免疫组化方法

    切片脱蜡，水化后，置柠檬酸抗原修复缓冲液中高温高压修复，冷至室温，PBS液冲洗，加过氧化酶阻断液，室温孵育10min，PBS液冲洗3次×3min，加非免疫性动物血清，室温孵育10min，甩去血清后加MMAC1单抗，置4℃湿盒中过夜，PBS液冲洗3次×5min，加生物素标记的二抗，室温孵育10min，PBS液冲洗3次×3min，加链霉菌抗生物素—过氧化物酶溶液，室温孵育10min，PBS液冲洗3次×3min，加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下控制染色，苏木素复染，盐酸酒精（0.1%）分化，PBS液冲洗返蓝，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

    1.3   结果判定

    阳性MMAC1蛋白免疫组织化学染色主要位于细胞浆，呈棕黄色，在高倍镜下(×400)随机观察3个视野。染色结果结合阳性细胞百分率和染色强度进行半定量分析。结果判定标准：阴性为0分，染色弱但明显高于阴性对照为1分，染色清晰为2分，染色强为3分。阳性细胞百分率< 10%为0分；10%～25%为1分；25%～50%为2分；>50%为3分。两项指标之和≤2分为阴性(-)，>2分为阳性(+)。

    1.4   统计学处理

    采用χ2检验和Fisher’s精确检验（P<0.05有统计学意义），采用SPSS统计软件处理。

    2   结   果

    2.1   MMAC1蛋白在膀胱组织中的表达

    10例正常膀胱黏膜组织中MMAC1蛋白均为阳性表达，20例腺性膀胱炎组织和40例BTCC组织中MMAC1蛋白的表达率分别为75.00%和67.50%，正常膀胱黏膜与BTCC中MMAC1阳性表达率有显著性差异（P<0.05），见表1。

    2.2   MMAC1蛋白表达与BTCC临床病理特征的关系

    MMAC1蛋白阳性表达率随着BTCC病理分级的增加而下降；随着临床分期的增加而下降（P<0.05）；在其他临床病理特征上无显著性差异（P>0.05），见表2。

    3   讨   论

    MMAC1/PTEN/TEP1是1997年克隆到的一种新的肿瘤抑制基因，定位于人染色体10q23.3[1]，有9个外显子和8个内含子，其cDNA开放阅读框编码的蛋白由403个氨基酸组成，MMAC1蛋白定位于细胞浆。MMAC1是至今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，具有双特异磷酸酶活性，其作用机制如下：①通过脂质磷酸酶活性对脂质底物PIP3去磷酸化，对PI3K/PKB/Akt信号转导途径起负调控作用，从而阻止细胞生长及诱导细胞凋亡[2]；②通过蛋白磷酸酶活性对蛋白质底物FAK(局部粘附激酶)去磷酸化，下调FAK下游分子p130Cas及抑制PI3K的活性，从而抑制细胞浸润、生长[3]；③通过蛋白磷酸酶活性选择性抑制ras/raf/MEK/ERK?鄄MAPK信号通路的活化而抑制细胞生长分化、迁移[4]。

    研究证实MMAC1基因在多种人体正常组织中高表达，而在人体增殖细胞、良性肿瘤、癌中部分或完全失活。Aveyard JS等[5]对123例膀胱癌进行分析，浸润性膀胱癌中MMAC1缺失达32%，而浅表性癌中仅4例发生杂合性丢失（6.6%），认为MMAC1的缺失发生在高级别的膀胱癌中，膀胱癌杂合性丢失发生率低，可能还存在其他MMAC1灭活的机制。Liu等[6]研究了11株膀胱癌细胞系，其中1株存在MMAC1基因纯合性缺失，2株存在基因突变(错义突变)，而在33例膀胱癌标本中未检测到编码区域的突变和缺失。Tanaka等[7]对几株膀胱癌细胞系转染MMAC1基因，发现能抑制其生长,并恢复其对阿霉素的敏感性。将MMAC1基因转染到人膀胱癌细胞系BIU?鄄87，可明显抑制肿瘤细胞的增殖活性和侵袭力[8]。

    腺性膀胱炎是一种特殊的膀胱黏膜上皮化生、增生性和慢性炎症性病变。临床资料提示其与膀胱肿瘤有一定关系，目前多数学者将其视为一种癌前病变。本研究通过检测正常膀胱黏膜、腺性膀胱炎以及BTCC中MMAC1的表达，探讨MMAC1与BTCC发生、的关系。结果显示，正常膀胱黏膜中均有MMAC1的表达，而腺性膀胱炎和BTCC中MMAC1阳性表达率分别为75.00%、67.50%，呈下降趋势，这印证了MMAC1在调节细胞周期进展和细胞生存中起重要作用，其表达水平及活性改变，可引起细胞增殖失控而发生癌变。

    本研究中，腺性膀胱炎中MMAC1阳性表达率与正常膀胱黏膜或膀胱移行细胞癌比差异均无显著性，可能与研究样本量少有关，有待扩大样本量进一步研究。但腺性膀胱炎中膀胱黏膜毕竟已出现过度增生，且在正常膀胱黏膜与BTCC中MMAC1表达有显著性差异（P<0.05），推测MMAC1蛋白表达可能是正常膀胱黏膜生长的必要因素之一。MMAC1蛋白表达下降或缺失可能使膀胱黏膜生长失控，最终导致BTCC的发生。另外，本研究还显示，MMAC1的阳性表达率随着BTCC病分级的增高而呈下降趋势，在G1、G2、G3依次为89.47%、53.85％、37.50％，G1与G2、G3间有显著性差异，G2与G3间无显著性差异，可能与这两组样本量少有关系，将G2、G3两组合并为中低分化组（G2+3）后再与高分化组（G1）相比，两者间差异有显著性，这表明MMAC1与BTCC的分化程度及病理学分级有关。浅表性（Tis~T1）BTCC中MMAC1阳性表达率为80.00％，而浸润性（T2~T4）BTCC中为46.67％，两者间差异有显著性，表明MMAC1表达与BTCC浸润程度及临床分期相关。由于BTCC的病理组织分级、临床分期是判断预后最重要的因素，因此，MMAC1蛋白表达可作为判断BTCC恶性生物学行为的指标之一。

【参考】
  [1] Steck PA,Pershouse MA, Jasser SA, et al. Identification of a candidate tumor suppressor gene,MMAC1, at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers[J]. Nat Genet,1997,15(4):357-362.

[2] Mahimainathan L，Choudhury GG. Inactivation of platelet?鄄derived growth factor receptor by the tumor suppressor PTEN provides a novel mechanism of action of the phosphatase[J]. J Biol Chem, 2004, 279 (15):15258-15268.

[3] Tamura M,Gu J, Matsumoto K, et al. Inhibition of cell migration, spreading, and focal adhesions by tumor suppressor PTEN[J]. Science,1998, 280(5369):1614-1617.

[4] Chu EC, Tarnawski AS. PTEN regulatory functions in tumor suppression and cell biology[J]. Med Sci Monit, 2004, 10(10):235-241.

[5] Aveyard JS, Skilleter A, Habuchi T, et al. Somatic mutation of PTEN in bladder carcinoma[J]. Br J Cancer,1999, 80(5?鄄6):904-908.

[6] Liu J,Babaian DC,Liebert M, et al. Inactivation of MMAC1 in bladder transitional?鄄cell carcinoma cell lines and specimens[J]. Mol Carcinog, 2000, 29(3):143-150.

[7] Tanaka M, Grossman HB. In vivo gene therapy of human bladder cancer with PTEN suppresses tumor growth, downregulates phosphorylated Akt, and increases sensitivity to doxorubicin[J]. Gene Ther, 2003, 10(19):1636-1642.

[8] 张建华, 杨为民, 周四维. PTEN基因转染对人膀胱癌细胞系BIU?鄄87增殖和侵袭力的影响[J]. 中华实验外科杂志, 2006, 23(3):368.