c?myc 反义核酸对乳腺癌MCF?7细胞生长及hTERT基因表达的影响
作者：马莉,税青林,张莉娟,彭春,赵小平
【摘要】 目的 探讨脂质体介导c?myc基因反义寡核苷酸（Antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide，ASODN）对MCF?7细胞生长及其人体端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）基因表达的影响。 方法 将c?myc正、反义寡核苷酸（ODN）分别导入各组MCF?7细胞中，MTT法、逆转录?聚合酶链法及流式细胞术分别检测各组细胞生长情况、hTERT mRNA的表达水平以及细胞凋亡率。结果 c?myc ASODN转染MCF?7细胞24h后，细胞生长受到抑制（P＜0.05），并且hTERT mRNA表达明显降低；随着反义核酸作用时间的延长，凋亡细胞数目逐渐增多，细胞生长及hTERT表达的下降随时间延长逐渐明显。对照组、LR?SODN组、LR?ASODN 24h组与LR?ASODN 48h、72h组相比有明显统计学差异（P＜0.05）。结论 c?myc反义寡核苷酸能显著下调细胞中hTERT基因的表达活性，诱导MCF?7细胞凋亡，并抑制MCF?7细胞生长；在一定程度上，其效果与时间呈正相关。
【关键词】 乳腺肿瘤；c?myc；人端粒酶逆转录酶；反义核酸；MCF?7细胞
Abstract：Objective To investigate the effects of c?myc ASODN on MCF?7 cells growth and the expression of hTERT gene in MCF?7 cells.Methods After transfecting c?myc SODN and ASODN to MCF?7 cells,we measured the proliferation,apoptosis rates and the expression of hTERT mRNA respectively by MTT method,flow cytometry analysis and RT?PCR.Results When c?myc ASODN affected MCR?7 cells at 24h,cells growth was inhibited significantly (P＜0.05) with hTERT gene expression of MCF?7 cells descending significantly (P＜0.01).The apoptosis rates of the ASODN?treated cells rised significantly at 48h.The described effects of suppression on cells rised with time increasing.Conclusion c?myc ASODN can effectively inhibit the MCF?7 cells growth,induce apoptosis,and down?regulate hTERT gene expression in MCF?7 cell.The effects correlated with time to a degree.
Key words：Breast neoplasms; c?myc; Human telomerase reverse transcriptase; Antisense Oligonucleotide; MCF?7 cell
0引言
端粒酶是维持染色体结构和功能稳定的一种核糖核蛋白复合体，在几乎所有的人类恶性肿瘤细胞中均高表达[1]。其最重要的成分是人端粒酶催化亚单位，又称人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT），被认为是端粒酶激活的限速因素。随着hTERT基因克隆[2]成功，对其的调控研究成为端粒酶研究的重点。
c?myc是一类参与细胞增殖与分化的原癌基因，通过基因扩增、逆转录酶插入和染色体易位等方式表达失调，在大多数的肿瘤中都有高水平的表达[3，4]，并且c?myc是第一个被发现的调节hTERT基因表达的重要转录因子[5]。许多研究报道，在恶性肿瘤细胞中c?myc与hTERT 的表达密切相关。Oh 等[5]报道，与正常细胞相比，myc蛋白在肿瘤细胞中表达显著增高；激活或抑制myc蛋白表达可以改变hTERT启动子活性，认为myc蛋白对hTERT启动子的调节作用可能与其促进肿瘤形成有关。而目前也有研究显示[6]，c?myc与hTERT的表达调控无明显相关性。由此可见，研究者们对于c?myc与hTERT的表达调控关系仍持不同意见。
本研究选用c?myc和hTERT均高表达的乳腺癌MCF?7细胞，采用Lipfect AMINETM介导的反义核酸技术将c?myc反义核酸转染入MCF?7细胞，观察细胞生长抑制、细胞凋亡以及hTERT基因表达的变化，为针对端粒酶抑制的乳腺癌肿瘤基因提供理论依据，并从逆向角度进一步探讨c?myc对hTERT基因表达的调控作用。
1材料与方法
1.1 细胞培养
采用含5% FBS（60℃灭活30min）、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基，在37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养人乳腺癌MCF?7细胞系。实验选用指数生长期细胞。
1.2c?myc正、反义寡核苷酸转染
c?myc 正、反义寡核苷酸由上海Sangon公司合成并行全硫代磷酸化修饰，经NCBI blast证实与人类其他已知基因无同源性。序列分别为：反义序列（ASODN）：5′?AAC GTT GAG GGG CAT?3′；正义序列（SODN）：5′?ATG CCC CTC AAC GTT?3′。将细胞分为对照组、LR?SODN组与LR?ASODN组。转染按照报道[7]中所述，并有些改动：ASODN和SODN的终浓度均为2.5μmol/L，脂质体相对浓度为10％；对照组细胞只加同量培养基。
1.3MTT法检测细胞生长的情况
取出c?myc SODN 及ASODN分别作用24h、48h、72h后的各组细胞,每孔加入终浓度为5mg/ml的MTT溶液200μl，5h后加入DMSO溶解振荡10min，酶标仪测570nm波长的OD值。绘制各组细胞存活率曲线。细胞抑制率（%）=（1－处理组OD值/ 对照组OD值）×100%。实验重复5次。
1.4 RT?PCR方法检测hTERT基因mRNA的表达水平
hTERT基因PCR扩增引物参照Takakura等的方法设计，并经GenBank检索证实，hTERT上游引物序列：5′?CGG AAG AGT GTC TGG AGC AA?3′；hTERT下游引物序列：5′?GGA TGA AGC GGA GTC TGG A?3′，扩增片段长度为145bp。内对照β?肌动蛋白（β?actin）基因扩增片段长度为540bp。上述引物均由上海Sangon公司合成。
分别收集上述各组MCF?7细胞，提取总RNA后，采用紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度，1.2%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取样品完整性。按照MMLV一步法RT?PCR进行扩增反应，以β?肌动蛋白（β?actin）作为内对照，设置50μl反应体系：模板RNA 1μl、2×反应混合液25μl、MMLV/Taq Mix 1μl、hTERT上下游引物均 1μl、内对照β?actin基因上下游引物均0.3μl，加无菌双蒸水至50μl。37℃ 30min，94℃ 2min；94℃ 15sec，57℃ 30sec，68℃ 90sec，35个循环，最后68℃ 5min。扩增产物在1.7%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶图象分析仪分析RT?PCR产物的电泳结果，用hTERT与β?actin的灰度扫描比值表示hTERT mRNA相对表达量，实验重复5次。
1.5AnnexinⅤ?FITC/PI双染色法流式细胞计数仪检测分析转染细胞凋亡情况
AnnexinⅤ?FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自Biovision公司。用0.25%的胰酶消化收集各组细胞，冷PBS洗涤2次，1×AnnexinⅤ缓冲液悬浮细胞，调整细胞浓度为1×106 /ml，取100细胞悬液（1×105细胞）加入5μl AnnexinⅤ?FITC和5μl PI，混匀，于暗处室温孵育15min。每管加入400μl 1×AnnexinⅤ缓冲液，过滤后在1h内进行流式细胞仪检测。AnnexinⅤ阳性／PI阴性判断为早期凋亡。实验重复5次。
1.6统计学分析
数据采用±s表示，进行单因素方差分析，均由SPSS11.0软件统计包完成。检验水准：α=0.05。
2结果
2.1不同处理组对MCF?7细胞生长的影响
经LR介导反义c?myc作用24h后，细胞生长出现抑制；作用48h后，细胞生长抑制率明显升高。将各组OD值进行比较显示： LR?ASODN 24h、48h、72h组与空白对照组、LR?SODN 组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组与LR?SODN 组比较,无统计学差异(P>0.05)，见表1。表1 LR介导c?myc正反义寡核苷酸对MCF?7细胞生长的影响（略）
MMLV一步法RT?PCR反应扩增后，凝胶电泳紫外灯下直接观察，各组在100 bp DNA ladder Marker 145bp处见明暗不一的hTERT扩增产物，于540bp处可见明暗一致的内对照β?actin扩增产物，见图1。紫外凝胶成像灰度扫描后，进行单因素方差分析，结果显示：ASODN作用于MCF?7细胞24、48、72h时hTERT mRNA相对表达量分别与对照组、LR?SODN组相比，差异有统计学意义（P<0.01）；而SODN作用于MCF?7细胞24、48、72h hTERT mRNA相对表达量分别与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。并且在一定范围内，LR?ASODN各组hTERT mRNA相对表达量随时间的递增而明显降低，见表2。表2 LR介导c?myc正反义寡核苷酸对MCF?7细胞凋亡及hTERT基因表达的影响（略）
MCF?7细胞经LR介导反义c?myc处理后，流式细胞仪检测显示在一定范围内，随着时间的延长，细胞凋亡率明显增高，见表2。统计学分析显示：对照组、LR?ASODN 24h组及LR?SODN各组之间无统计学差异（P＞0.05）；LR?ASODN 48h、72h组与对照、LR?ASODN 24h及LR?SODN各组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。
3讨论
hTERT基因表达的上调是端粒酶激活的主要途径，而c?myc是参与hTERT调控的重要因子，它能通过激活hTERT的表达而导致肿瘤发生。分析hTERT序列发现[8,9]，hTERT基因结构的内含子和启动子序列中有多个转录因子的潜在结合位点，其中 c?myc可与hTERT基因启动子E盒结合，激活靶基因的转录，从而影响端粒酶活性的表达及细胞的增殖和分化。林勇等[10]利用瞬时转染实验，采用在脂质体LipfectAMINETM（LR）介导下，将含有c?mycDNA质粒分别转染入肝癌细胞HepG2、猴肾COS?7细胞和NIH3T3细胞，结果发现c?myc可以直接激活hTERT启动子的表达，且c?myc的激活作用与其剂量呈正相关。Oh等[5]还应用c?myc反义核酸作用Hela细胞，发现c?myc和hTERT基因表达均下降且两者呈平行关系。
本研究用相对定量RT?PCR检测反义c?myc作用MCF?7细胞后hTERT mRNA表达水平，发现：c?myc SODN作用于MCF?7细胞24h、48h、72h后，hTERT mRNA表达均无明显变化（P＞0.05）；而c?myc ASODN作用于MCF?7细胞24h后，hTERT mRNA相对表达量即出现明显下降，抑制率达25％，作用48h、72h后抑制率进一步升高，分别为62％和80％，与对照组相比均存在统计学差异（P＜0.01）。可见抑制效果随时间的延长逐渐增强。这一结果进一步证明，c?myc是hTERT基因表达的重要调控因子。c?myc高表达上调hTERT基因表达水平，进而上调端粒酶活性，这是端粒酶活性调节的重要机制。
另外，在本实验中发现，c?myc反义寡核苷酸作用于MCF?7细胞72h后，hTERT mRNA表达量仍可达到0.143±0.011，抑制率为80%，即hTERT基因表达未被完全抑制，与林勇等[10]得出的结论相符。表明c?myc反义核酸只能下调hTERT基因表达，并不能完全封闭该基因。这一结果进一步证明c?myc对hTERT的调控不是唯一的影响因素。
虽然hTERT启动子区有E盒与c?myc相互作用，且目前许多研究结果也都有证实,但有研究在应用RT?PCR方法检测乳腺癌组织中端粒酶与c?myc mRNA[11]及hTERT mRNA与c?myc mRNA表达水平时[6]，发现c?myc mRNA与端粒酶表达之间无明显关系，而且hTERT mRNA与c?myc mRNA表达之间亦无明显关系。而且在乳腺癌组织中hTERT蛋白与c?myc蛋白表达之间也不存在明显关系[12]。因此，作者认为hTERT的调控无疑是非常复杂的，要结合其他的细胞调控途径综合评价。例如有研究者就指出[13]，Mad1可作为myc调控途径的一个因子，抑制hTERT的转录水平。因此要了解hTERT与c?myc的调控关系究竟是怎样的，还应结合细胞和组织两个水平进一步证实。
近年来许多研究表明，端粒酶及其催化亚基－hTERT活性下调后，端粒序列不完全复制，导致随着细胞分裂端粒重复片段的丢失，进而肿瘤细胞染色体不稳定，诱导DNA损伤反应，细胞周期受阻，最终肿瘤细胞发生凋亡或死亡。本实验中，c–myc反义核酸转染乳腺癌MCF?7细胞后，24、48、72h时各组细胞抑制率分别为5.85%、32.18%、62.47%；流式细胞仪定量检测反义c?myc寡核苷酸作用24、48、72h时，各组细胞凋亡率为4.64%、13.50%、28.76%，凋亡指数明显高于正常对照组细胞。结果表明，脂质体介导的反义c?myc下调hTERT基因表达的同时，能有效抑制MCF－7细胞生长，并诱导细胞凋亡，在一定程度上，其效果与时间呈正相关。经流式细胞仪检测发现，早期坏死细胞比例并没有升高，说明ASODN对细胞的抑制并不是直接的细胞毒作用，而是反义核酸的反义作用效应。而Yamaguchi等[14]用hTERT的反义载体转染到神经胶质瘤细胞后，出现端粒酶活性受到抑制，但转染后2个月仍未出现细胞死亡。以上结果表明除了影响端粒的长度外，端粒酶还可能通过其他途径（例如半胱氨酸蛋白激酶家族成员瀑布式的信号传导通路）参与细胞凋亡，从而导致细胞凋亡发生的速度各不相同。
端粒酶是目前所发现的恶性肿瘤细胞中最广谱的分子标记，在绝大多数肿瘤细胞中被激活，而在正常体细胞中一般为阴性表达，因此端粒酶是进行肿瘤基因的理想靶点。在肿瘤基因治疗研究中，结合本研究结果，作者认为靶向c?myc针对端粒酶抑制的肿瘤基因治疗是一种有效的基因治疗策略。但是在肿瘤细胞中，端粒酶活性的调控是多因子、多水平、多阶段进行的，在不同种类细胞中，端粒酶的激活机制不尽相同，因此端粒酶的靶向基因治疗尚需针对多靶基因、多途径进一步深入探讨。
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