非小细胞肺癌多药耐药性病理学检测的临床意义
【摘要】 目的 检测113例非小细胞肺癌（NSCLC）中谷胱甘肽巯基转移酶π（GST?π）、肺耐药相关蛋白（LRP）、DNA拓扑异构酶Ⅱa（TopoⅡa）、多药耐药相关蛋白（MRP）和多药耐药基因（MDR1）的表达，观察上述指标与肿瘤临床病理因素的关系及各指标表达之间的相关性。方法 采用免疫组化SP法检测GST?π、LRP、TopoⅡa蛋白的表达；应用原位杂交技术检测MRP和MDR1 mRNA表达。结果 (1)GST?π、LRP、TopoⅡa蛋白及MRP、MDR1 mRNA在113例NSCLC中的阳性表达率分别为75.2%、80.5%、60.2%、79.6%、51.3%。其中LRP表达最高，MDR1表达最低。(2)LRP、TopoⅡa和MRP的表达分别与肿瘤组织学类型有关。(3)GST?π与MRP（P＜0.05）、LRP与MRP（P＜0.01）、MDR1与MRP（P＜0.01）的表达间具有相关性。结论 (1)多种耐药相关基因的过度表达及其相互作用可能是NSCLC产生原发MDR的重要原因。(2)LRP和MRP过度表达，TopoⅡa高表达和MRP低表达可能分别与肺腺癌、鳞癌的化疗敏感性有关。
【关键词】 非小细胞肺癌; 多药耐药; 免疫组化; 原位杂交
Abstract：Objective To evaluate the expressions of GST?π, LRP, TopoⅡa, MRP and MDR1 in 113 non?small cell lung cancer(NSCLC), to observe their relationships with clinicopathologic characterization of cancer and their interactions.Methods Expressions of GST?π, LRP and TopoⅡa were detected by S?P immunohistochemistry, and expressions of MRP, MDR1 mRNA in paraffin?embedded cancer tissues were detected by in situ hybridization.Results (1)The positive rates of GST?π, LRP, TopoⅡa and MRP, MDR1 mRNA were 75.2%, 80.5%, 60.2%,79.6% and 51.3% in NSCLC, respectively.(2)The expressions of LRP, TopoⅡa, MRP had a close relationship with the histological types in NSCLC, respectively.(3)There were significant relationships between positive rates of GST?π and MRP(P＜0.05), LRP and MRP(P＜0.01), MDR1 and MRP(P＜0.01), respectively.Conclusion (1)The overexpressions and interactions of GST?π, LRP, TopoⅡa, MRP and MDR1 are important causes of primary MDR in NSCLC. (2)The overexpressions of LRP and MRP, the overexpression of TopoⅡa and the reduced expression of MRP, which are related with the chemotherapeutic sensitivity in adenocarcinoma and squamous carcinoma, respectively.
Key words：Non?small cell lung cancer; Multidrug resistance; Immunohistochemisty; In situ hybridization
0 引言
多药耐药是指肿瘤对一种化疗药物出现耐药的同时，对其他许多结构不同、作用机制各异的化疗药物亦产生交叉耐药的现象。与小细胞肺癌相比，非小细胞肺癌（NSCLC）的联合化疗有效率较低，其耐药性更为突出。本研究采用免疫组化和原位杂交技术，对NSCLC组织中5种多药耐药相关蛋白或mRNA的表达进行检测，试图深入了解NSCLC的多药耐药状况、相互关系及不同耐药机制，为NSCLC病例制定合理的化疗方案提供理论依据。
1 资料和方法
1.1 病例来源
收集武汉大学中南病理科1996～2000年5年间存档并经病理确诊的NSCLC手术切除病例共113例。所有病例术前均未经放、化疗，其中男91例，女22例；年龄34～77岁，均龄57岁；鳞癌39例，腺癌（含细支气管肺泡癌）61例，腺鳞癌13例；高分化癌43例，中分化癌47例，低分化癌23例。113例中，淋巴结送检者共90例（有淋巴结转移者37例，无淋巴结转移者53例），23例无淋巴结送检记录；按TNM分期，Ⅰ期52例，Ⅱ期26例，III期11例，Ⅳ期1例，23例无记录。标本均经10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，连续切片厚 4～5μm 。
1.2 实验方法
1.2.1 切片制作
标本均经10%中性Formalin液固定，常规脱水，石蜡包埋，4μm 厚切片。每例切片6张。1张HE染色，用于肿瘤常规病理诊断及分类。3张免疫组化染色，用于观察肿瘤中GST?π、LRP及TopoⅡa蛋白表达；2张原位杂交，用于检测肿瘤中MRP和MDR1 mRNA表达。
1.2.2 免疫组化染色及原位杂交
采用免疫组化SP法。所用鼠抗人GST?π、LRP及TopoⅡa单克隆抗体分别购于福州迈新生物技术公司、上海仪涛生物仪器有限公司，均为即用型。以已知阳性切片作阳性对照，PBS取代一抗作阴性对照。
原位杂交所用地高辛标记MDR1、MRP寡核苷酸探针及检测试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。检测方法按试剂盒说明书进行。用已知阳性片作阳性对照，以预杂交液代替一抗作阴性对照。
1.2.3 结果判断
除TopoⅡa蛋白阳性表达为细胞核着棕黄色外，GST?π、LRP蛋白、MRP和MDR1 mRNA阳性表达均为胞浆呈棕黄色颗粒。每例随机取10个高倍视野（×400），计数其阳性细胞百分率。阳性细胞率＞5%定为阳性，≤5%视为阴性 [1]。
1.2.4 统计学处理
采用SPSS 11.5统计软件，以双向无序R×C表的χ2检验及Fisher精确检验作指标间的差异和相关性分析。P＜0.05为显著性检验标准。
2 结果
2.1 5种多药耐药相关蛋白或mRNA在NSCLC中的表达
①LRP蛋白在NSCLC中的阳性表达率最高，见图1～5。MDR1 mRNA表达率最低；②LRP、TopoⅡa蛋白和MRP mRNA表达与NSCLC组织学类型有关。LRP蛋白的表达为腺癌＞腺鳞癌＞鳞癌，其在腺癌中的表达明显高于腺鳞癌、鳞癌（P＜0.05）；TopoⅡa蛋白在鳞癌中表达最高，明显高于腺癌和腺鳞癌（P＜0.05）；MRP mRNA在鳞癌中的表达明显低于腺鳞癌和腺癌（P＜0.05）; ③上述5种多药耐药相关蛋白或mRNA的表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移状态及临床分期均无相关性（P＞0.05）,见表1。表1 113例NSCLC中5种多药耐药相关蛋白或mRNA的表达(略)
2.2 5种多药耐药相关蛋白或mRNA表达间的相关性
统计学分析表明，GST?π蛋白与MRP mRNA（P＜0.05）、LRP蛋白与MRP mRNA（P＜0.01）、MDR1 mRNA与MRP mRNA（P＜0.01）表达间均具有正相关关系。其余多药耐药蛋白或mRNA表达间无相关性。
3 讨论
多药耐药基因MDR1属于人类MDR基因家族。P糖蛋白（P?gp）为MDR1基因的编码产物，MDR1基因可导致其过量表达。P?gp定位于胞膜和内质网周边，是一种跨膜蛋白质，可将进入癌细胞内的抗癌药物泵出癌细胞并导致癌细胞耐药 [2]。MDR1几乎在所有肿瘤类型中都有表达，但其表达水平与肺癌耐药性和预后的关系尚一直存在争议。多数学者认为MDR1与肺癌多药耐药无关，甚至有学者提出MDR1 mRNA和蛋白表达与NSCLC化疗敏感性或细胞内/核内顺铂的蓄积无关的观点 [3]。尚有学者认为二者间存在明显的关系 [4]。本研究中MDR1在未经的NSCLC中的阳性表达率为51.3%，表明其可能是导致肿瘤多药耐药的因素之一；但MDR1在本研究5种多药耐药相关蛋白或mRNA中表达率最低，且其表达与临床病理因素均无关，说明MDR1与NSCLC生物学表型的关系尚需进一步研究。
大量研究表明，MRP基因表达是NSCLC原发多药耐药的重要参与因素，尤其参与肿瘤对长春新碱、依托泊甙和阿霉素等药物原发性耐药的形成过程 [5]。本组113例NSCLC中，MRP阳性表达率为79.6%，提示NSCLC具有与MRP基因相关的原发性耐药，且其表达与肿瘤组织学类型有关，在肺鳞癌中的阳性表达率分别明显低于腺鳞癌和腺癌（P＜0.05），这与Wright等 [6]的报道基本一致。最近Doubre等 [7]提出MRP1在DNA异倍体细胞中的阳性细胞百分率显著高于DNA二倍体细胞，认为其表达可用于预测肿瘤对化疗的反应性，主张对DNA异倍体肿瘤应采用不同于二倍体肿瘤的治疗方法。
1998年Ikeda等 [8]发现LRP在14个肺癌细胞系中均呈阳性表达，且其mRNA水平与多种抗肿瘤药物的交叉耐药有关。Berger等 [9]观察了16个NSCLC细胞系中LRP的表达，发现每个细胞系均有不同水平LRP表达，且与顺铂的耐药明显相关。在培养基中加入柔红霉素与博来霉素后，有一半细胞中LRP表达显著升高。上述研究表明LRP在NSCLC中表达频率非常高，与肿瘤内在性和获得性MDR均有密切关系。在本研究观察的5种多药耐药相关蛋白或mRNA表达中，LRP表达水平最高（80.5%），尤其在肺腺癌中的表达分别明显高于腺鳞癌和鳞癌。我们的观察结果不仅与报道相符，而且进一步说明LRP是导致NSCLC多药耐药的主要原因 [10]。
一般认为，GST?π在不少肿瘤中均有明显的基因扩增及表达水平增高，是目前认为与肿瘤耐药关系最为密切的一种GST。Nakanishi等 [11]用免疫组化法观察54例未经治疗的NSCLC，结果GST?π阳性表达率为69％，但其阳性表达组和阴性表达组的化疗反应率却分别为16％和47％。最近Unsal等 [12]提出，GST?π的表达并不总能预测NSCLC对含有顺铂的联合化疗药物的反应性。本组NSCLC病例中，GST?π阳性表达率为75.2%，但其表达与各临床病理因素间均无相关性。因此，GST?π在NSCLC中的表达意义尚需继续深入探讨。
TopoⅡa是一种能催化DNA超螺旋结构局部构型改变的基因核酸，尤其是TopoⅡa是肿瘤化疗的重要靶点。目前应用的TopoⅡ抑制剂是通过形成药物－酶－DNA复合物干扰酶的活性，从而影响肿瘤细胞DNA代谢而发挥其细胞毒作用，而肿瘤细胞对TopoⅡ抑制剂的敏感性则主要取决于细胞内TopoⅡ的水平。Kreisholt等发现，在未经治疗的NSCLC中，TopoⅡa表达明显低于SCLC的表达，说明TopoⅡa数量减少和/或活性降低与肿瘤的耐药明显相关，也是NSCLC原发耐药形成因素之一 [13]。本组NSCLC中，TopoⅡa的阳性表达率为60.2%，提示其也是肿瘤原发耐药的形成因素之一。TopoⅡa在本组肺鳞癌中的阳性表达率明显高于腺癌和腺鳞癌（P＜0.05），与肺鳞癌对化疗药物较敏感的临床实际相符合。在NSCLC的化疗中，有计划地对TopoⅡa高表达的肺鳞癌应用TopoⅡ抑制剂可能会取得更好的疗效。
本研究结果表明，GST?π与MRP、LRP与MRP、 MDR1与MRP在NSCLC表达间存在明显或显著相关性，表明NSCLC原发MDR的形成是一个多因素、多步骤的复杂过程，其中包括多种耐药相关基因的参与及相互协同作用。因此，深入研究肿瘤MDR现象及其机制，对制定有针对性个体化治疗方案，提高NSCLC患者的化疗效果具有重要意义。（本文图见第164页）
【文献】
［1］余少平，熊永炎，田素芳.非小细胞肺癌多药耐药及其神经内分泌分化的相关性研究 [J].中华结核和呼吸杂志，2003，26（3）：165?168.
［2］Huang X, Li L, Guo Z, et al. Immunoelectron microscopic analysis of P?glycoprotein, p53, and Bcl?2 protein expressions in Lung cancer [J]. Zhonghua zhong liu za zhi(Chinese journal of oncology), 2001, 23(1): 53?56.
［3］Ikuta K, Takemura K, Sasaki K, et al. Expression of multidrug resistance proteins and accumulation of cisplatin in human non?small cell lung cancer cells [J]. Biol Pharm Bull, 2005, 28(4): 707?712.
