甲基莲心碱对乳腺癌MCF?7/Adr细胞MDR逆转的研究

【摘要】  目的 探讨甲基莲心碱（Neferine,Nef）对耐药人乳腺癌细胞增殖，细胞内ADM积聚浓度及mdr?1/P?gp表达的影响。方法 采用MTT法测定细胞毒作用，高效液相色谱法测定细胞内ADM积聚浓度，RT?PCR技术及蛋白质印迹技术检测mdr?1/P?gp表达。 结果 10μg/ml Nef+ADM组细胞的抑制率及细胞内ADM积聚浓度比ADM组高(P<0.01)；20μg/ml Nef+ADM组细胞抑制率及细胞内ADM积聚浓度较5μg/ml异博定+ADM组及10μg/ml Nef+ADM组均高(P<0.01)。10μg/ml Nef+ADM组MCF?7/Adr细胞mdr?1 mRNA及P?gp表达比ADM组明显下降（P<0.01）。20μg/ml Nef+ADM组细胞mdr?1 mRNA及P?gp表达较10μg/ml Nef+ADM组明显下调（P<0.01）。结论 Nef能抑制耐药人乳腺癌细胞增殖。Nef能增加MCF?7/Adr细胞内ADM积聚浓度。Nef通过降低耐药人乳腺癌细胞mdr?1 mRNA及P?gp的表达逆转MDR。

【关键词】  甲基莲心碱；多药耐药；P?糖蛋白；MCF?7/Adr细胞

　　The Study of Neferine on Multidrug Resistance Reversing of the Human Breast Cancer Cell Line MCF?7/Adr

　　Abstract：Objective   To investigate the effect of neferine(Nef) on the proliferation, intracellular ADM concentration and the expression of mdr?1/P?gp in human breast cancer cell line MCF?7/Adr.Methods  MTT method was used to observe cell proliferation. High performance liquid chromatography was used to detect intracellular ADM concentration. RT?PCR and Western?blotting were used to detect mdr?1/P?gp expression. Results  The inhibiting rate and intracellular ADM concentration of  10μg/ml Nef adding ADM group were significantly higher than those of ADM group (P<0.01). The inhibiting rate and intracellular ADM concentration of 20μg/ml Nef adding ADM group were significantly higher than those of 5μg/ml verapamil adding ADM group and 10μg/ml Nef adding ADM group (P<0.01). The mdr?1 mRNA and P?gp expression of 10μg/ml Nef adding ADM group was significantly lower than those of 60μg/ml ADM group（P<0.01）.  The mdr?1 mRNA and P?gp expression of 20μg/ml Nef adding ADM was significantly lower than that of 10μg/ml Nef adding ADM group group（P<0.01）.Conclusion  Neferine can inhibit the proliferation of human breast cancer cell line MCF?7/Adr. Neferine can improve the intracellular ADM concentration. Neferine can reduce mdr?1  mRNA and P?gp expression and consequently reverse MDR.

　　Key words：Neferine；Multidrug resistance；P?glycoprotein； MCF?7/Adr cell line

　　0  引言
   
　　统计表明，90％以上肿瘤患者死因都与多药耐药(Multidrug resistance，MDR)有关，MDR是导致肿瘤化疗失败的主要因素之一。报道大部分难治/复发白血病和许多实体瘤（如乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、头颈部肿瘤等）及其转移灶细胞mdr?1/P?gp表达增加。尤其是MDR患者高表达。肿瘤MDR逆转已成为肿瘤化疗亟待解决的问题。中药抗白血病悠久，其有效成分在与化疗联合应用的过程中有着较好的减毒增效作用。我们既往研究发现甲基莲心碱（Neferine，Nef）具有化疗增敏作用[1]。本研究以MCF?7/Adr细胞株为研究对象，探讨甲基莲心碱对耐阿霉素人乳腺癌细胞株的逆转作用。

　　1  材料与方法  

　　1.1  主要试剂
   
　　阿霉素(Adriamycin，ADM)：意大利 Pharmacia and Upjohn公司产；异博定(Verapamil)：上海禾丰制药有限公司产；Nef：由华中科技大学同济医学院药教研室惠赠；噻唑蓝（MTT）购自Sigma公司；P?糖蛋白（P?glycoprotein，P?170）单抗：购自美国NeoMarkers公司；Trizol：购自美国 Invitrogen公司；RT?PCR试剂盒：购自美国MBI公司；化学发光检测试剂购自美国PERCE公司。mdr1及β?actin上、下游引物均由上海申友生物技术有限责任公司合成。

　　1.2  实验细胞
   
　　MCF?7/Adr细胞由中南大学湘雅医学院细胞中心提供。在1.0μg/μl浓度ADM中培养维持其耐药性，脱ADM半月后进行实验。所有的细胞均接种于含10％小牛血清的RPMI1640培养体系中，置于37℃、体积分数为5％的CO2、95％湿度的条件下培养，每隔3～4天传代1次。

　　1.3  实验方法 

　　1.3.1  MTT法测定Nef对MCF?7/Adr细胞的增殖抑制  对数生长期的MCF?7/Adr细胞接种于96孔培养板中，每孔含5×104个细胞，每组设4个复孔，分阴性对照组、实验组和阳性对照组。阴性对照组不加任何药物，实验组加入不同浓度的Nef和(或)浓度为60μg/ml  ADM，阳性对照组加入5μg/ml异博定和60μg/ml  ADM。各组加样培养72h后，再加入12.07nmol/L的MTT 20μl/孔，培继续养4h后吸弃上清，加DMSO100μl/孔终止反应并使甲臜颗粒充分溶解，全自动酶标仪（EXL800UV型，美国Bio?Tek公司）570nm波长检测各孔OD值，取各组均值，重复3次实验。以下面的公式细胞毒性及逆转倍数。细胞毒性（死亡率）（％）＝（1－不同处理组OD570/阴性对照组OD570）×100％，逆转倍数＝逆转剂加抗癌药物组细胞毒性/抗癌药物组细胞毒性[2]。

　　1.3.2  HPLC测定MCF?7/Adr细胞内ADM积聚浓度[3]   取对数生长期的MCF?7/ Adr细胞按上述分组加入相应浓度的药物后培养1h，1h后除阴性对照组外各组均加入浓度为9.6μg/ml的ADM标准品。混匀后继续培养，于1、3h各取1ml（含1.0×106个细胞）细胞制成细胞悬液，置-20℃冰冻保存。测定前室温融解样本，以40HZ超声波破碎细胞1min，离心4 000r/min×30min，取上清以HPLC测定细胞内ADM含量。

　　1.3.3  逆转录PCR法检测mdr?1 mRNA的半定量表达  按上述方法分组处理MCF?7/Adr细胞48h后，每组取1×106个细胞，Trizol提取总RNA后合成cDNA条件。PCR扩增条件：94℃预变性5min后进入PCR循环，94℃  30s，55℃  60s，72℃  70s，28个循环后再72℃  10min。PCR产物电泳后在凝胶图像处理仪（Eagle EyeⅡStill Video System，美国Stratagene公司）上扫描半定量，将mdr?1 cDNA/ β?actin cDNA的光密度比值作为mdr?1 mRNA的相对表达水平。

　　1.3.4  Western印迹法检测P?gp的半定量表达  取各组待测蛋白60μg点样，98V恒压电泳5h后4℃120mA恒流转膜。以2μg/ml浓度的P?gp一抗孵育NC膜70min，TBS洗膜液洗膜10min×3次，1:200浓度的二抗孵育60min，洗膜10min×3次，用化学发光试剂反应5 min，发光成像仪取像。所测P?gp/β?actin条带的灰度面积比值来表示P?gp的半定量值。

　　1.4  统计学方法
   
　　实验结果资料为计量资料，采用±s表示，组间两两比较采用方差分析及t检验。实验资料均经SPSS11.0进行统计处理。

　　2  结果

　　2.1  Nef对MCF?7/Adr细胞增殖的影响
   
　　用Nef、异博定及ADM处理MCF?7/Adr细胞72h后，10μg/ml Nef+ ADM组MCF?7/Adr细胞的死亡率比ADM组高，OD值明显变小，有显著统计学意义（P<0.01）。10μg/ml Nef+ ADM组与5μg/ml异博定+ADM组对MCF?7/Adr细胞的抑制率大致相等，两处理组对MCF?7/Adr细胞耐药的逆转倍数均为1.5左右，无统计学意义（P>0.05）。20μg/ml Nef+ADM组MCF?7/Adr细胞的死亡率比5μg/ml异博定+ADM组及10μg/ml Nef+ADM组均高，且前者逆转倍数较后两处理组大（P<0.01）,见表1。

　　2.2  Nef对MCF?7/Adr细胞内ADM积聚浓度的影响
   
　　用9.6μg/ml ADM、Nef、5μg/ml异博定处理MCF?7/Adr细胞1h和3h之后用HPLC检测细胞内ADM的含量，结果表明处理1h和3h后Neferine +ADM组和异博定+ADM组比纯ADM组显著升高（P<0.01）。处理1h和3h之后10μg/ml Nef+ADM组较5μg/ml异博定+ADM组MCF?7/Adr细胞内ADM积聚浓度稍升高，但无统计学意义（P>0.05）。20μg/ml Nef+ADM组较5μg/ml异博定+ADM组MCF?7/Adr细胞内ADM积聚浓度明显升高（P<0.01），结果见表2。

　　2.3  Nef对MCF?7/Adr细胞株mdr?1 mRNA及P?gp表达的影响

　　表1  Nef对MCF?7/Adr细胞株增殖抑制作用（略）

　　注：与ADM组比较，△P<0.01、▲P<0.01、▲▲P<0.01；与▲比较，△P<0.01

　　表2  Nef对MCF?7/Adr细胞ADM积聚浓度的影响（略）

　　注：与ADM组比较,▲P<0.01、▲▲ P<0.01、△P<0.01；与▲▲比较，△P<0.01   

　　用Nef、5μg/ml异博定及60μg/ml  ADM处理MCF?7/Adr细胞48h之后检测其mdr?1  mRNA及P?gp表达。10μg/ml  Nef+ADM组和5μg/ml异博定+ADM组MCF?7/Adr细胞mdr?1 mRNA及P?gp表达比60μg/ml ADM组明显下调（P<0.01）。10μg/ml  Nef+ADM组MCF?7/Adr细胞mdr?1 mRNA及P?gp表达和5μg/ml异博定+ADM组的表达无统计学意义（P>0.05）。20μg/ml  Nef+ADM组MCF?7/Adr细胞mdr?1  mRNA及P?gp表达较10μg/ml  Nef+ADM组明显下调（P<0.01）,见表3,图1、2。

　　表3  Nef对MCF?7/Adr细胞mdr?1 mRNA及P?gp表达的影响（略）

　　注：与ADM组比较，△P<0.01、▲P<0.01、▲▲P<0.01；与▲比较，△P<0.01

　　3  讨论
   
　　多种机制参与肿瘤MDR形成，其中较重要并且研究得较深入的是mdr?1基因及其编码的P?gp过度表达导致的MDR。控制肿瘤耐药基因高表达是解决MDR的关键[4,5]。理想的逆转剂应该对正常的组织无毒性或低毒性，药物在体内能达到体外试验的有效逆转浓度，有稳定而较长的半衰期，能主动代谢。相继发现了异博定、环孢菌素等多种耐药逆转剂，但它们因具有心血管毒性、免疫抑制、肾毒性等严重毒性和不良反应而使其临床应用受到限制[6]。MCF?7/Adr细胞是体外采用阿霉素诱导建立的耐药乳腺癌细胞株，具有高表达mdr?1/P?gp及GST?π等MDR特点，已成为研究MDR逆转的重要细胞模型。

　　M:Marker;1:无药细胞组；2:60μg/ml  ADM组;3:10μg/ml Nef+ADM组;4:5μg/ml异博定+ADM组;5:20μg/ml Nef+ADM组

　　图1  mdr?1基因 PCR产物电泳图（略）

　　1：无药细胞组; 2：60μg/ml  ADM组;  3：10μg/ml Nef+ADM组;4：5μg/ml异博定+ADM组;5：20μg/ml Nef+ADM组

　　图2  P?gp的Western印迹（略）

　　Nef系睡莲科植物莲的成熟种子绿色胚芽中提取出来的一种双苄基异喹啉生物碱，药理研究证实其具有钙通道阻滞剂样的作用。本实验结果显示，10μg/ml  Nef+ADM组与5μg/ml异博定+ADM组细胞抑制率大致相等，逆转倍数均为1.5左右。但20μg/ml Nef+ADM组对MCF?7/Adr细胞的抑制率较异博定+ADM组明显增加，显示出Nef较强的抑制功效。P?gp作为一种能量依赖性外排泵，可主动把细胞内化疗药物泵出，使细胞内药物浓度下降。大量研究表明，钙拮抗剂通过竞争性抑制P?gp的外排而逆转MDR。MCF?7/Adr细胞经不同浓度Nef处理1h和3h后，细胞内ADM积聚浓度较5μg/ml异博定＋ADM组明显升高，表明Nef能减弱耐药细胞的“药泵”功能，增加细胞内ADM积聚浓度从而逆转耐药。本研究发现20μg/mlNef明显降低MCF?7/Adr细胞mdr?1 mRNA及P?gp半定量表达，和阳性对照组异博定＋ADM组及10μg/ml  Nef＋ADM组比较具有显著统计学的差异，在基因转录及蛋白表达两种不同水平下调mdr?1/P?gp表达，从分子水平体现了其较强的耐药逆转功效。此外叶祖光等[7]研究发现Nef有明显的增强长春新碱诱导人乳腺癌MCF?7多药耐药细胞的凋亡作用。对K562/A02细胞MDR研究发现，Nef通过降低K562/A02细胞mdr?1/P?gp表达，降低K562/A02细胞内谷胱甘肽的含量，下调K562/A02细胞GST?πmRNA转录和蛋白表达等途径逆转MDR[8,9]。以上表明，Nef可以通过多种途径逆转耐药肿瘤细胞MDR，为临床作为逆转剂的应用开发提供了有力的理论依据。

【】
  　　[1] 黄程辉,谢兆霞,秦忆,等. 甲基莲心碱对难治/复发急性白血病细胞增殖及P?糖蛋白表达的影响[J]. 医师杂志,2005,7(9):14?16.

　　[2] 李大成,屈艺,刘柏林,等.三种中药制剂Ams?11、Fw?13、Tul?17逆转肿瘤细胞多药耐药性的研究[J].华西医科大学学报,1998,29(1):16?20.

　　[3] 刘树业,陈秀琴,张志友.血液和组织中抗癌药物阿霉素的紫外?HPLC分析[J]. 2002,22(1):57?59.

　　[4] Kim DH, Lee NY, Sung WJ, et al. Multidrug resistance as a potential prognostic indicator in acute myeloid leukemia with normal karyotypes[J]. Acta Haematol, 2005, 114(2):78?83.

　　[5] Lee JJ, Swain SM. Development of novel chemotherapeutic agents to evade the mechanisms of multidrug resistance (MDR)[J]. Semin Oncol,2005, 32(S7):22?26.

　　[6] Davidson A, Dick G, Pritchard?Jones K, et al. EVE/cyclosporin (etoposide,vincristine,epirubicin with high dose cyclosporin) chemotherapy selected for multidrug resistance modulation [J]. Eur J Cancer,2002,38(18):2422?2427.

　　[7] 叶祖光,王金华,孙爱续,等. 粉防己碱、甲基莲心碱和蝙蝠葛碱增强长春新碱诱导人乳腺癌MCF?7多药耐药细胞凋亡[J].药学学报,2001,36(2):96?99.

　　[8] 肖希斌,谢兆霞,秦群. 甲基莲心碱抑制K562/A02细胞GST?π的表达[J]. 西安大学学报(医学版), 2005,26(5):428?431.

　　[9] 林秀梅,谢兆霞,秦群. 甲基莲心碱、红霉素对K562/A02细胞内谷胱甘肽的影响[J]. 中南大学学报(医学版),2004, 29(3):284?286.