重组人微小染色体维持蛋白MCM5的原核表达和纯化
【关键词】 MCM5蛋白；原核表达；纯化
0 引言
MCM5蛋白是一种DNA复制调控蛋白，属于MCM蛋白质家族［1］。MCM5蛋白的表达作为一种增殖细胞的标记物受到关注，抗MCM5蛋白的抗体可以用来检测肿瘤细胞［2－3］。MCM5蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达，通过洗涤、层析可以得到纯度较高的MCM5包涵体蛋白［4］。本研究的成功为进一步进行相应抗体的制备奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料 大肠杆菌pBAD/Thio?TOPO菌株和pBAD载体均购自Invitrogen公司。L?Arabinose为Sigma公司产品，NI?NTA HisBind ?Superflow亲和层析柱为Novagen公司产品。其余为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 人MCM5蛋白的cDNA重组质粒pBAD/Thio?TOPO?MCM5的克隆与测序（略）
1.2.2 细胞转化与原核表达 将经DNA测序验证的pBAD/Thio?TOPO?MCM5转化感受态表达菌pBAD/Thio?TOPO，当A600为0.8～1.0h，加L?Arabinose(终浓度1mM)诱导表达，4h后收获细菌，称湿重，于-20℃冻存备用。
1.2.3 人MCM5蛋白表达菌的提取 将1000 ml培养菌离心后(约6 g)加50 ml缓冲液A(50mM Tris?HCL，pH 8.5，2mM EDTA,100mM Nacl,0.5% Triton X?100)，同时以1∶1 000加入蛋白酶抑制剂 (终浓度0.1mM)于冰浴中超声破碎，DNaseⅠ水解DNA。以12 000 r/min，4℃离心30 min,弃上清。沉淀用含4M脲的TE洗液（10mM Tris?Hcl pH 8.0,1mM EDTA ,4M脲）洗涤。4℃离心弃上清。用变性液（0.1M Tris?Hcl pH 8.0，6M盐酸胍，2mM EDTA,0.5% β?Me）溶解包涵体，室温放置2h。4℃离心保留上清。上清将作为层析分离纯化的蛋白样品。
1.2.4 人MCM5蛋白的纯化 表达的融合蛋白的N端含有His?Tag,故用金属Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白。用含100mM 咪唑的PBS洗脱目的蛋白，每管1 ml。4℃透析过夜。再过Sephadex G?75分子筛柱进一步纯化、透析除盐,蛋白定量。
2 结果
人MCM5的重组质粒pBAD/Thio?TOPO?MCM5转化TOP1O，经L?Arabinose诱导后可大量表达产物。SDS?PAGE结果表明：最终的纯化表达产物显示出分子量为39 kD的一条蛋白条带，该分子量与预期结果一致，说明分离纯化是成功的。
3 讨论
重组人MCM5蛋白在E.coli中的表达
MCM蛋白首先在啤酒酵母中被发现，是一个关系密切序列高度保守的家族，由MCM2，-3，-4（Cdc21），-5 (Cdc46),-6(Mis5),和-7(CDC47)六个保守亚基组成六聚体，表现复制型DNA解旋酶的活性[5]。其中MCM5用于表达相当恒定而受到关注，其染色体定位为22q13.1→q13.2，由734个氨基酸组成。研究证明，抗MCM5抗体可以作为增殖细胞的标志物，应用于组织学和细胞学标本的检测[2]。我们构建了人MCM5蛋白的第367～582位的氨基酸，并成功表达出pBAD?MCM5重组蛋白。
本研究利用原核载体pBAD在E.coli TOP10中高效表达并纯化了融合蛋白pBAD/Thi?MCM5。所选用的pBAD/TOPO?ThioFusionTM表达系统含有一个L?Arabinose的启动子，只有加入诱导剂L?Arabinose后，目标蛋白才能得以表达。目标蛋白为不可溶性蛋白，以包涵体的形式存在，不溶原因是在宿主系统高水平表达的重组蛋白合成速度太快，没有足够的时间进行折叠二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，以及重组蛋白无法达到足够的溶解度。细胞裂解后离心弃上清，将得到的沉淀溶于缓冲液，再次洗涤离心。由于pBAD/TOPO?ThioFusionTM表达系统所表达的融合蛋白含有His?tag结构，因此通过Ni2+柱进行纯化，可得到纯化的MCM5蛋白，通过稀释变性剂的浓度和透析除去变性剂，使目标蛋白恢复到有功能的高级结构。
重组人MCM5融合蛋白的高效表达和纯化为下一步制备抗体奠定了基础。
【】
［1］ Mark AM，Magdalena S，et al.The role of the MCM，ORC，and Cdc6 proteins in Detemining the Replication Competence of Chromatin on Quiescent Cell /[J/] .J Structural Biology， 2000，129:198?210.
［2］Williams GH， Romanowski P，Morris L， et al. Improved cervical smear assessment using antibiodies against proteins that regulate DNA replication/[J/] . Proc Natl Acad Sci USA， 1998，95:3603?3608.
［3］ Freeman A，Morris L，Mills AD，et al.The minichromosome maintenance proteins as biological markers of dysplasia and malignancy/[J/] .Clin Cancer Res，1999，5：2121?2132.
［4］ 朱厚础.蛋白质纯化与鉴定实验指南/[M/].北京：出版社,2002.154?157.
［5］ Laskey RA，Madine MA.A rotary pumping model for helicase function of MCM proteins at a distance from replication forks/[J/] . EMBO Rep，2003，4:26?30.
