应用荧光原位杂交法检测乳腺癌石腊样本中HER-2基因的扩增

【摘要】  目的 探讨荧光原位杂交法（Fluorescence in situ hybridization, FISH）检测乳腺癌HER?2基因扩增在临床病理诊断及分子靶向中应用的可能性。方法 用FISH技术和免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）技术检测50例乳腺导管癌石蜡包埋标本并比较两种方法的结果以及与临床病理的关系。结果 16/50例HER?2蛋白表达阳性，其中强阳性5例，中度阳性9例，弱阳性2例；11/50（22%）例乳腺癌标本FISH技术检测HER?2基因扩增阳性，其中5/5为免疫组化HER?2蛋白强阳性病例；6/9为中度阳性病例，其中1例为17号染色体多倍体与HER?2基因扩增。HER?2基因扩增与蛋白表达与乳腺癌转移有关（P<0.05）。结论 FISH技术可稳定地检测用IHC确定的HER?2蛋白阳性乳腺癌中HER?2基因的扩增状况，并用于临床赫赛汀分子靶向治疗病例的筛选。

【关键词】  HER?2/癌基因；荧光原位杂交；乳腺癌

　　Application of Fluorescent in Situ Hybridization (FISH) to Detect the  Amplification of HER?2 Gene in Paraffin  Sample  of  Breast Cancer

　　Abstract：Objective   To explore the possibility of application with the method to detect amplification of HER?2 gene by fluorescence in situ hybridization (FISH) in clinical pathology and molecular targeting therapy in breast cancer, and investigate the relationship between HER?2 gene amplification and clinicopathological data.Methods  Detecting 50 cases of formalin?fixed and paraffin?embeded breast ductal carcinoma samples   compared with result of immunohistochemistry and then analyzed with clinicopathological data.Results  Sixteen of fifty (32.0%) cases of breast carcinoma presented positive for HER?2 protein expression, including 5 strong, 9 moderate and 2 weak expressions, respectively. Eleven of fifty （22.0%）cases of breast cancer showed positive for HER?2 gene amplification, in which 5/5 was the cases showing strongly positive and 6/9 presenting moderately positive expression for HER?2 protein by immunohistochemistry. And the one with both amplification of HER?2 gene and polysomy of chromosome 17 was also moderately positive expression for the protein. Both gene amplification and protein expression of HER?2 were corresponding to metastasis of lymph nodes (P<0.05).Conclusion  FISH technique can stably detect the amplification of HER?2 gene especially for the positive cases for HER?2 protein and it is clinically useful to select the cases for molecular targeting therapy of Herceptin in breast cancer.

　　Key words：HER?2/oncogene; FISH; Breast cancer

　　0  引言
   
　　原瘤基因HER?2/neu 的研究是当前研究的热点之一[1?3]。目前女性乳腺癌中，有25%～30%的病人有这种基因扩增。报道15%～20%的浸润性乳腺癌和多达60%的导管原位癌有HER?2基因和蛋白的表达。大规模研究证实HER?2阳性的肿瘤预后不良，其基因扩增与乳腺癌的复发、转移有关。通过抑制细胞活化信号的传递，而专用于治疗HER?2基因扩增乳腺癌的单克隆抗体赫赛汀已通过美国FDA认证，并已成功应用于临床，对于乳腺癌的治疗和预后均具有重要意义[4?6]。我们应用HER?2基因探针，用荧光原位杂交法（FISH）检测乳腺癌标本，并结合免疫组化检测(IHC)HER?2蛋白表达状况，比较两种方法的差异，以及与临床病理的联系，为临床进一步应用该技术筛选赫赛汀用药病例及选择治疗方案提供可靠的依据。

　　1  材料与方法

　　1．1  材料
   
　　标本选自本科2003年1月～2005年8月的手术切除、福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺癌标本50例，其中浸润性导管癌45例、导管内癌5例；有23例浸润性导管癌手术时伴局部或腋下淋巴结转移。PathVysion HER?2 DNA探针试剂盒购自美国Vysis公司的产品。荧光显微镜使用日本奥林帕斯公司（型号BX51）的产品。

　　1.2  方法 

　　1.2.1  FISH技术  检测HER?2/neu基因原位杂交实验操作采用直接法：标本固定于10%中性福尔马林液24～48h石蜡包埋，用金刚笔选择出组织实验区域。经4～5μm厚切片,二甲苯脱蜡，100%乙醇脱二甲苯后空气干燥或45～50℃烤片2～5min。0.2N  HCL 20min，经纯水充分洗涤后，2×SSC 缓冲液洗片3min；1M NaSCN（异硫酸氰钠） 80℃ 30min（温度要求准确）,纯水及缓冲液洗片后，将组织片放入蛋白酶溶液  37℃ 10min（250mg/500ml   0.01NHCL）。纯水洗涤后,切片入中性福尔马林10min。2×SSC缓冲液洗，45℃～50℃ 2～5min干燥切片；处理后的切片进入72℃变性液5min；经75%、85%、100%酒精各1min，空气中干片；滴加10μl探针混合液在组织片靶区域，上盖18×18mm盖玻片并用蜡胶封边。放入原位杂交仪中,37℃过夜（14～18h）。将切片置后洗液（2×SSC，0.3% NP?40）中漂浮盖玻片，组织片入后洗液72℃ 2min后将其放置在室温暗处干燥，滴加10μl DAPI显色液在组织片靶区域，盖玻片封片，荧光显微镜观察结果。

　　1.2.2  免疫组化技术  常规切片、脱蜡入纯水。组织片放入EDTA  pH8.0修复液在高压锅内高压2.5min。0.01MPBS液洗片后入3% H2O2 10min。充分洗涤后加入一抗37℃60min。0.01MPBS液洗片3min×3，加入二抗37℃40min；洗涤后加DAB显色液，显微镜下观察信号并终止显色，苏木素衬染，脱水、透明、封片。

　　1.3  结果判定标准
   
　　荧光原位杂交细胞核内橘红色的HER?2基因荧光信号和17号染色体的绿色荧光信号的数目比值，≥2.0者为阳性扩增或细胞核内＞4个橘红色的HER?2基因荧光信号[1]。免疫组化以癌细胞胞膜呈棕褐色信号为阳性,根据染色强度分为弱阳性(+)、中度阳性（++）和强阳性（+++）。

　　1.4  统计学方法
   
　　采用非参数检验判断HER?2基因扩增和蛋白表达与淋巴结转移的相互关系，P<0.05 为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2．1  乳腺癌HER?2基因扩增及HER?2蛋白表达情况
   
　　FISH结果：癌细胞核显示蓝色荧光信号，17号染色体着丝粒（centromere）位于核内显示绿色荧光信号，HER?2基因位于核内显示红色荧光信号。 细胞核内橘红色的HER?2基因荧光信号和17号染色体的绿色荧光信号的数目比值，≥2.0者为阳性扩增。正常或间质细胞及阴性对照的信号比值＜2.0。本实验荧光原位杂交检测结果显示，浸润性乳腺癌11/50（22.0%）例HER?2基因扩增。免疫组化结果：乳腺癌16/50（32.0%）HER?2蛋白表达阳性，其中强阳性5例；中度阳性9例，弱阳性2例。HER?2蛋白表达阳性信号位于细胞膜呈棕褐色，见表1。

　　表1  50例乳腺癌样本荧光原位杂交与免疫组化检测结果（略）

　　注：Immuno=immunohistochemistry
   
　　本组5例免疫组化HER?2蛋白强阳性病例均为 HER?2基因扩增(5/5)， 见图1a、b；9例HER?2蛋白中度阳性的病例有6例HER?2基因扩增(6/9)，见图1c、d；1例HER?2基因同时伴17号染色体多倍体，见图1e。2例蛋白弱阳性病例基因检测未见扩增。

　　2．2  HER?2基因扩增、蛋白表达与乳腺癌组织侵犯和转移的关系 
   
　　本研究50例乳腺癌中，16例（32.0%）HER?2蛋白表达阳性，均见于浸润性导管癌，为浸润性导管癌病例的35.6%（16/45）；HER?2蛋白表达病例在伴淋巴结转移癌组的分布为47.8%（11/23）；而在未伴淋巴结转移癌组的分布为18.5%（5/27）。5例导管内癌HER?2蛋白表达均为阴性（0/5）。本研究50例乳腺癌中伴淋巴结转移癌组HER?2蛋白表达阳性率（47.8%）与未伴淋巴结转移癌组者（18.5%）比较，差异有统计学意义（P=0.028）；本组50例乳腺癌中，11例（22.0%）HER?2基因扩增阳性，亦均见于浸润性导管癌，为浸润性导管癌病例的24.4%（11/45）；HER?2基因扩增病例在伴淋巴结转移癌组的分布为34.8%（8/23）；而在未伴淋巴结转移癌组的分布为11.1%（3/27）。5例导管内癌HER?2基因扩增均为阴性（0/5）。本研究50例乳腺癌中伴淋巴结转移癌组HER?2基因扩增阳性率（34.8%）与未伴淋巴结转移癌组者（11.1%）比较，差异有统计学意义（Р=0.046）， 见表2。

　　表2  HER?2蛋白及基因改变与临床病理的关系（略）

　　3  讨论
   
　　目前常用的HER?2蛋白与基因的检测方法是免疫组织化学（IHC）和荧光原位杂交法（FISH）。通常认为HER?2 IHC检测结果为强阳性及FISH扩增的浸润性乳腺癌可被确定为HER?2阳性，并用于指导是否选择赫赛汀单抗进行[7,8]。而HER?2蛋白为中度阳性的乳腺癌患者中，多数患者FISH检测HER?2基因扩增为阴性，但也有一定数量的阳性，因此美国FDA要求必须用FISH技术检测出该基因的扩增才能进行赫赛汀的治疗。本组实验乳腺癌IHC 方法检测16/50例（32%）HER?2蛋白阳性，FISH技术检测11/50（22%）例乳腺癌HER?2基因扩增，与报道基本一致；其中免疫组化结果呈强阳性的5例，用FISH方法检测均有基因扩增，与国外的研究一致[3]；免疫组化中度阳性的9例，用FISH方法检测有6例为基因扩增，其中1例为17号染色体多倍体并HER?2基因扩增,也与Lan、 Dolan等的报告相似[7,8]。根据以上结果我们认为，诊断明确的乳腺癌病例可用IHC方法初步筛选HER?2基因扩增阳性病例。IHC结果阴性或弱阳性的乳腺癌则表示没有HER?2过度表达，同时亦可能提示HER?2基因扩增阴性；此时再作FISH的意义不大，也很可能不太适合使用赫赛汀治疗；反之，由于免疫组织化学法有假阳性的存在，即HER?2蛋白表达不一定存在基因的扩增，特别是HER?2蛋白中度阳性的病例应进一步进行FISH检测分析来确定是否存在基因的扩增。应该指出的是，IHC和FISH检测试剂必须是经过认证的标准试剂盒，蛋白阳性信号表达定位应在细胞膜上，HER?2基因扩增必须同时有17号染色体信号作为参照。IHC结果强阳性及FISH结果基因扩增是乳腺癌进行赫赛汀有效治疗的标准。本组HER?2基因扩增和HER?2蛋白表达均与乳腺癌的转移有关（P均<0.05），提示有一定的预后意义。
   
　　实验操作中需注意：标本必须用10%中性福尔马林固定；变性应完全；蛋白酶的浓度应适当，过高影响组织结构，过低则影响阳性信号的表达；杂交后标本在后洗液中应严格掌握温度与时间，可降低背景。本实验的缺点是国外试剂较昂贵，仅适用于大中型开展。

【参考文献】
  　　[1] Bozionellou V, Mavroudis D, Perraki M, et al. Trastuzumab administration can effectively target chemotherapy?resistant cytokeratin?19 messenger RNA?positive tumor cells in the peripheral blood and bone and bone marrow of patients with breast cancer[J]. Clin Cancer Res, 2004,10(24):8185?8194.

　　[2] Bozzetti C, Nizzoli R, Guazzi A, et al. HER?2/neu amplification detected by fluorescence in situ hybridization in fine needle aspirates from primary breast cancer[J]. Ann Oncol, 2002, 13(9):1398?1403.

　　[3] Press MF, Sauter G, Bernstein L, et al. Diagnostic evaluation of HER?2 as a molecular target: an assessment of accuracy and reproducibility of laboratory testing in large, prospective, randomized clinical trials[J]. Clin Cancer Res, 2005, 11(18):6598?6607.

　　[4] Vogel CL, Reddy JC, Reyno LM. Efficacy of trastuzumab[J]. Cancer Res, 2005, 65(5): 2044.

　　[5] Slamon DJ, Romond EH, Perez EA. Advances in adjuvant therapy for breast cancer[J]. Clin Adv Hematol Oncol, 2006, 4(3): suppl 1, 4?9.

　　[6] Nabholtz JM, Slamon D. New adjuvant strategies for breast cancer: meeting the challenge of integrating chemotherapy and trastuzumab (Herceptin)[J]. Semin Oncol, 2001, 28(1 Suppl 3):1?12.

　　[7] Lan C, Liu JM, Liu TW, et al. erbB2 amplification by fluorescence in situ hybridization in breast cancer specimens read as 2+ in immunohistochemical analysis[J]. Am J Clin Pathol, 2005, 124(1): 97?102.

　　[8] Dolan M, Snover D. Comparison of immunohistochemical and fluorescence in situ hybridization assessment of HER?2 status in routine practice[J]. Am J Clin Pathol, 2005, 123(5):766?770.