skp2、p27kip1在正常胃黏膜和胃癌组织中的表达
作者：黄韬 吕会增 朱小峰 周秀田 欧阳军 李汉贤
【摘要】 ［目的］ 探讨细胞S相激酶相关蛋白2（skp2）和细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白27（p27kip1）表达与胃癌发生的关系。［方法］ 用免疫组化SP法检测69例胃癌组织中skp2、p27kip1蛋白的表达，并与28例正常胃黏膜作对比； 用RT-PCR方法随机检测其中3例胃癌组织中skp2的mRNA表达，并与其正常胃黏膜作对比。［结果］ p27 kip1蛋白阳性表达率在胃癌中为46.38%，而正常胃组织中为96.43%(P<0.01)。p27kip1蛋白在胃癌中的阳性表达率随肿瘤分化程度的降低、浸润深度的加深、淋巴结转移、病理分期进展而降低(P<0.05)。skp2 mRNA在胃癌组织中的表达明显上调(P<0.01)。skp2蛋白阳性表达率在胃癌中为33.33%，而正常胃组织中为10.71%(P<0.05)。skp2蛋白阳性表达率随肿瘤的分化程度降低而升高 (P<0.05)。skp2、 p27 kip1蛋白在胃癌中的表达呈负相关(P<0.01)。［结论］ p27 kip1、skp2蛋白检测有助于胃癌的临床诊断及判断预后。
【关键词】 胃肿瘤 细胞S相激酶相关蛋白2 细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白27
skp2 and p27kip1 Protein Expressions between Normal Gastric Mucous Membrane and Gastric Carcinoma Tissue
Abstract: ［Purpose］ To explore the relationship between expressions of S-phase kinase-associated protein 2 (skp2), cyclin dependent kinase inhibitor protein 27 (p27kip1) and gastric carcinogenesis. ［Methods］ The protein expressions of p27kip1 and skp2 were detected by immunohistochemistry SP method in 69 cases with gastric carcinoma, 28 cases with normal gastric mucous membrane were examined as control group. Three cases randomized from 69 cases with gastric carcinoma were examined by reverse transcription polymerase chain reaction method(RT-PCR) for the mRNA expression of skp2 and compared with their normal gastric mucous membranes as control. ［Results］ The positive expression rate of p27kip1 protein was 46.38% in gastric carcinoma, while that was 96.43% in normal gastric tissue(P<0.01). The positive expression rate of p27kip1 protein decreased with lower differentiation, deeper invasion, lymph node metastasis, advanced pathological stage (P<0.05). The expression of skp2 mRNA in gastric carcinoma was
up-regulated obviously(P<0.01). The positive expression rate of skp2 protein was 33.33% in gastric carcinoma, while that was 10.71% in normal gastric tissue(P<0.05). The positive expression rate of skp2 increased with lower differentiation(P<0.05). There was a negative correlation between the expressions of skp2 and p27kip1 in gastric carcinoma(P<0.01). ［Conclusions］ The examination of p27kip1 and skp2 protein is helpful to clinical diagnosis and prognostic evaluation in gastric cancer.
Key words: gastric neoplasms; S-phase kinase-associated protein 2; cyclin dependent kinase inhibitor protein 27
肿瘤的发生是正常细胞染色体多重损伤的复杂过程，其最终表现均为细胞周期调控机制的紊乱。细胞S相激酶相关蛋白2（S-phase kinase-associated protein 2，skp2）特异作用于磷酸化的细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白27（cyclin dependent kinase inhibitor prtoin 27，p27kip1），使其通过泛素—蛋白酶体途径降解，与恶性肿瘤的发生有关[1，2]。抑癌基因p27kip1是细胞周期重要的负性调控因子，其缺失与肿瘤的发生、有关。我们通过对正常胃黏膜和胃癌组织中skp2 mRNA及skp2、p27kip1蛋白的检测，探讨它们与胃癌的发生及临床病理关系。
1 材料与方法
1.1 材 料
69例胃癌标本来自南华大学附属第一2001年4月~2002年1月收治的胃癌手术患者。其中男性46例，女性23例。年龄18～80岁,平均年龄50.7岁。胃窦部35例，胃体部27例，贲门部7例。高中分化27例，低分化42例。早期癌14例，侵犯肌层15例，累及浆膜和/或浆膜外器官组织者40例，伴淋巴结转移者48例。根据国际抗癌联盟1985年胃癌TNM分期标准：Ⅰ、Ⅱ期24例，Ⅲ、 Ⅳ期45例。任选3例根治性的胃癌标本，在新鲜肿瘤病灶及以远5.0cm正常胃黏膜处分别取材，标本含组织的黏膜及黏膜肌层，逆转录聚合酶链反应标本立即置于-196℃液氮罐中保存；免疫组化标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，片厚4μm,常规HE染色，标本经南华大学肿瘤研究所组织病教授检查证实。
1.2 方 法
1.2.1 逆转录聚合酶链反应检测skp2 mRNA
组织总RNA的提取按Trizol说明书进行，RT-PCR逆转录试剂盒、dNTP（Promega公司）、Taq酶(Sigma公司)、DNA Mark( MBI公司)，取组织总RNA 2μg，65℃变性3min，分别构建20μl逆转录体系。逆转录产物cDNA扩增，引物序列（上海生物技术有限公司合成）：skp2：上游 5′-GCTGCTAAAGGTCTCTGGTGT-3′；下游 5′-AGGCTTAGATTCTGCAACTTG-3′，扩增片段长度：291bp。内参照3-磷酸甘油醛脱氢酶 GAPDH：上游 5′-TCACCATCTTCCCAGGAGCGAG-3′；下游 5′-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3′，扩增片段长度：697bp。PCR反应条件：94℃变性4min后，94℃变性45s；复性45s：skp2 58℃、GAPDH 60℃；72℃延伸：skp2 1min，GAPDH 30s；30个循环后，72℃延伸10min。
1.2.2 免疫组化检测skp2、p27kip1的蛋白表达
鼠抗人p27kip1单克隆抗体，SP试剂盒及DAB显色剂由北京中山公司提供。skp2单克隆浓缩抗体由美国Zymed公司提供。pH 8.0的EDTA抗原修复液由福州迈新生物技术开发公司提供。免疫组织化学采用链霉素抗生物素蛋白—过氧化物酶法（strepotavidin-peroxidase，SP法）。切片常规脱蜡至水，在滴加封闭血清及一抗前，用1∶50的EDTA液(92℃~98℃)行抗原修复10min，一抗浓度：skp2为 1∶100、p27为1∶30,余染色步骤按试剂盒说明进行，DAB显色，苏木素复染。阳性对照用已知阳性片，阴性对照用PBS代替一抗。
1.3 结果判断
1.3.1 逆转录聚合酶链反应结果
正常胃黏膜组织和胃癌组织中skp2基因表达的灰度值分别与相对应的GAPDH灰度值相比，所得数据进行统计学比较。
1.3.2 免疫组化结果
阳性细胞为棕黄色颗粒位于细胞核或胞核伴胞质内，而只有胞浆出现棕黄色为非特异性染色，以每张切片癌细胞阳性数超过20%判断为阳性高表达。
1.4 统计学处理
采用SPSS 10.0统计学软件分析，逆转录聚合酶链反应实验数据用均数±标准差(x±s)表示，采用独立样本的t检验；四格表χ2检验或R×C表χ2检验；等级关联系数检验。
2 结 果
2.1 skp2 mRNA在胃癌组织和正常胃黏膜组织中的表达
RT-PCR检测随机3个胃癌组织和正常胃黏膜组织样本中skp2 mRNA的表达（图1）。skp2 mRNA在胃癌组织中表达明显增强，与正常胃黏膜组织中skp2 mRNA的表达相比较，经统计学处理，差异有显著性(t=-6.591，P<0.01)；方差齐性检验F=5.899，P=0.072。
2.2 p27kip1在正常胃黏膜及胃癌中的表达
免疫组化SP法检测p27kip1在正常胃黏膜及胃癌不同分化组织中的蛋白表达。正常胃黏膜组织p27kip1蛋白阳性表达率为96.43%（27/28），胃癌组织中p27kip1蛋白阳性表达率为46.38%（32/69），统计学比较差异有显著性(P<0.01)。早期胃癌组织中p27kip1蛋白阳性表达率为64.29%(9/14)，进展期胃癌组织中p27kip1蛋白阳性表达率为41.82%(23/55)，统计学差异无显著性(P>0.05)。
2.3 p27kip1蛋白表达与胃癌临床病理关系
p27kip1阳性表达率与胃癌组织分化程度、浸润深度、临床分期及有无淋巴转移有关，统计学比较差异均有显著性(P<0.05)，见表1。
2.4 skp2在正常胃黏膜及胃癌中的表达
免疫组化SP法检测skp2在正常胃黏膜组织及胃癌不同分化组织中的蛋白表达，skp2主要在胃癌细胞中表达，癌细胞胞核呈棕黄色。正常胃黏膜组织skp2蛋白阳性表达率为10.71%（3/28），胃癌组织中skp2蛋白阳性表达率为33.33%（23/69），统计学比较差异有显著性(P<0.05)。早期胃癌组织中skp2蛋白阳性表达率为28.57%（4/14），进展期胃癌组织中skp2蛋白阳性表达率为34.55%（19/55），统计学比较差异无显著性(P>0.05)。
2.5 skp2蛋白表达与胃癌临床病理关系
skp2蛋白阳性表达率与胃癌组织分化程度有关，统计学比较差异有显著性 (P<0.05)，见表2。
2.6 胃癌中p27kip1、skp2蛋白表达的关系
p27kip1与skp2在胃癌中表达的关系（表3），经统计学处理，两者间关联度呈显著负相关性(r=-0.762，P<0.01)，负相关连续胃癌组织切片见图2、3。
3 讨 论
3.1 p27kip1蛋白表达与胃癌的临床关系
p27kip1蛋白是一种非特异性周期素依赖激酶抑制剂，p27kip1蛋白表达水平及活性的改变与肿瘤的形成有关，p27kip1表达降低促使胃肠腺瘤向腺癌[5]。有关p27kip1蛋白表达在胃癌中的预后价值，国外的报道尚存在分歧[6~8]。本研究应用免疫组化SP法检测胃癌中p27kip1蛋白表达情况。结果示：①正常胃黏膜组织阳性表达率与胃癌组织相比较，有显著性统计学差异(P<0.01)。早期胃癌阳性表达率与进展期胃癌相比较差异无显著性(P>0.05)。提示p27kip1不仅与胃癌的发生有关，而且可为胃癌的临床诊断提供。究其原因，可能由于阳性表达的p27kip1对正常胃组织细胞异常增殖起抑制作用，而胃癌组织中p27kip1阳性表达率明显降低，不能对细胞异常增殖产生有效抑制，从而有利于肿瘤的发生。②p27kip1蛋白表达率与肿瘤不同分化程度、临床分期、有无淋巴结转移、浆膜浸润有关，p27kip1蛋白在胃癌中的阳性表达率随恶性肿瘤分化程度的降低、浸润深度的加深、淋巴结转移、临床分期进展而降低(P<0.05)。尤其在未累及浆膜且无淋巴结转移的高中分化胃癌中，p27kip1阳性表达率明显高于累及浆膜且发生淋巴结转移的低分化癌。p27kip1蛋白表达率在病理分期的Ⅲ、Ⅳ期较Ⅰ、Ⅱ期显著下降。提示p27kip1不仅与胃癌的恶性进展有关，而且能够对胃癌的临床预后判断提供参考。
3.2 skp2表达与胃癌的临床关系
目前已有实验表明：skp2 mRNA在多种恶性肿瘤中呈高表达，其相应的正常组织和良性分化肿瘤组织呈低表达[9]。我们的研究结果显示：skp2 mRNA表达水平在胃癌中明显增高，与正常胃黏膜组织中的skp2 mRNA表达水平有显著性差异(P<0.01)。提示skp2mRNA表达增高也是胃癌的重要恶性表型特征之一。
skp2是泛素—蛋白连接酶的底物识别亚基，特异作用于磷酸化的p27kip1，使其通过泛素—蛋白酶体途径降解，这是泛素—蛋白酶体途径调节细胞周期的机制[10]。我们的研究结果显示，skp2蛋白在胃癌组织中阳性表达率与正常胃黏膜组织相比，差异有显著性(P<0.05)。早期胃癌与进展期胃癌，阳性表达率无统计学差异(P>0.05)。提示skp2可能与胃癌的发生有关。skp2蛋白阳性表达率与胃癌分化程度有关(P<0.05)，随分化程度降低，其阳性表达率逐渐升高，尤其在低分化胃癌中，其阳性表达率明显升高(P<0.05)。提示skp2与肿瘤的恶性表型有关，检测其蛋白表达对判断胃癌的恶性分化程度有一定临床意义。但skp2蛋白表达率与肿瘤的临床分期、有无淋巴结转移及浆膜浸润无关(P>0.05)，提示在胃癌中尚有其他因素参与对p27kip1表达的调控。
3.3 skp2与p27kip1的关系
我们的研究结果显示：高表达skp2的肿瘤不同程度地低表达或缺乏p27kip1的表达，胃癌中skp2蛋白和p27kip1蛋白表达呈显著负相关(P<0.01)，与报道一致[11，12]。说明p27kip1的诱导表达在相当程度上依赖泛素—蛋白酶体途径。
综上所述，p27kip1、skp2的异常表达与胃癌的发生、发展有关, 其蛋白检测尤其是p27kip1蛋白检测可为判断胃癌恶性程度和预后提供重要参考, 泛素—蛋白酶体途径可能在胃癌发生机制中扮演着重要角色。
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