长春新碱诱导肝癌细胞自噬性凋亡过程中泛素与bcl?2的变化

【摘要】  目的 探讨长春新碱(VCR)诱导HepG2肝癌细胞自噬性凋亡过程中泛素表达的变化及阻断泛素?蛋白酶体通路对此凋亡和bcl?2表达的影响。方法 应用VCR诱导HepG2细胞自噬性凋亡，采用流式细胞仪检测凋亡及泛素的表达；以RT?PCR检测bcl?2的表达。结果 VCR处理后发生自噬性凋亡的HepG2细胞中泛素含量增加（P<0.01）。加用蛋白酶体特异抑制剂乳胞素后的乳胞素+VCR组凋亡率明显比单用VCR组高（P<0.01），而bcl?2表达则比单用VCR组更低。结论 泛素?蛋白酶体通路参与了VCR诱导的HepG2细胞自噬性凋亡及对bcl?2蛋白的调控。对蛋白酶体功能的抑制可以促进VCR诱导的HepG2细胞凋亡。

【关键词】  长春新碱；泛素?蛋白酶体通路；肝癌细胞；凋亡；bcl?2

    Key words：Vincristine;Ubiquitin?proteasome pathway;Hepatoma cell;Apoptosis; bcl?2

    新近的研究显示泛素?蛋白酶体通路（ubiquitin?proteasome pathway，简称泛素通路）是细胞凋亡调控的主要机制之一，这种机制可能是肿瘤等疾病的一个独特靶点，有关研究认为泛素通路参与凋亡的调控是通过对bcl?2蛋白的调节而发挥作用的[1]。长春新碱（vincristine,VCR）是一种常用的抗癌药物。本研究中，作者先用VCR诱导了人肝癌细胞系HepG2细胞自噬性凋亡，在此凋亡模型[2]基础上，特定研究了VCR诱导的HepG2细胞自噬性凋亡过程中泛素通路及bcl?2表达的有关变化。

    1  材料与方法

    1.1  细胞及培养

    人肝癌细胞系HepG2细胞（购自上海中科院细胞所）用含10%小牛血清的RPMI?1640培养液(Gibco BRL公司)培养。

    1.2  细胞分组与加药处理

    未加药对照组仅加等体积生理盐水。VCR处理组的药物处理基本同[2]（VCR为sigma公司产品），即于培养液中加入1μg/mL的VCR去诱导。在药物作用不同时间后用0.125%胰蛋白酶?EDTA消化收获细胞行以下实验。

    1.3  泛素的定量检测

    分别将对照组、VCR作用4h组、VCR作用16h组的HepG2细胞经固定、漂洗后加1∶200的抗泛素(博士德公司)，4℃过夜，加1∶64的IgG?FITC(Sigma产品)于室温作用30分钟后用Elite流式细胞仪(COULTER公司)分别检测各组平均荧光强度。

    1.4  bcl?2表达的RT?PCR检测

    1.4.1  被检测细胞分三组：对照组、VCR 16h组、乳胞素+VCR 16h组。乳胞素(Lactacystin，CALBIOCHEM公司)为蛋白酶体的抑制剂，使用浓度为10μM[3]，细胞加用乳胞素8h后再加用VCR处理16h。

    1.4.2  用Goldkey软件设计bcl?2引物，由上海生物工程公司分别合成，bcl?2扩增引物为sense: 5′GGACAACATCGCCCTGTG3′(551～568); antisense: 5′AGTCTTCAGAGAACAGCCAGGA3′(668～688), 扩增片段为137bp；内参照GAPDH扩增引物为sense: 5′GGTGAAGGTCGGTGTCAACG 3′；antisense: 5′caaagttgtcatgcatgacc 3′，扩增片段为496 bp。

    1.4.3  RNA分离用Trizol reagent总RNA分离试剂盒(Gibco公司)从细胞中提取细胞RNA。

    1.4.4  cDNA合成用THERMOSCRIPT RT?PCR System试剂盒（Gibco公司）将分离的RNA逆转录成cDNA。

    1.4.5  PCR以此cDNA为模板行扩增反应。RT?PCR反应体系：模板20μL,上游引物（10μmol/L）和下游引物(10μmol/L)各2μL，dNTP4μL(10mmol/L)，10×Taq多聚酶缓冲液10μL，TaqDNA聚合酶1μL(5u)。PCR循环参数为94℃，1.5min；52℃，1.5min；72℃，2.5min;44个循环后72℃，20min。

    1.4.6  取PCR产物行电泳分析(电泳仪、电泳槽为Bio?Rad公司产品)。以X174?Hinc II digest DNA Marker(TaKaRa Biotech)为分子量参照。

    1.5  细胞凋亡率的FCM检测

    分别检测对照组、VCR 4h组、VCR 16h组、乳胞素+VCR 16h组的细胞凋亡率：约1×106个各组细胞经固定、漂洗后加1%RNase37℃作用30分钟，随后分别加入PI(50μg/ml)避光染色；流式细胞仪测定DNA含量。低于G1期二倍体DNA含量的细胞为凋亡细胞。各组均测定10 000个细胞，由流式细胞仪平均凋亡百分率，统计处理采用χ2检验。

    2  结果

    2.1  泛素及细胞凋亡率的FCM检测见表1。表1  VCR各组抗泛素的FITC标记荧光 平均荧光强度及凋亡率*:经F检验，P＜0.01;**:经χ2检验，P＜0.012.2  VCR、乳胞素对HepG2细胞bcl?2的mRNA水平的影响  两对引物进行RT?PCR后获得137bp(bcl?2)和496bp(GAPDH)两条带(见图1)，用凝胶图像分析仪分析电泳结果，各组bcl?2与GAPDH的比值分别是：正常对照组为0.736，VCR组为0.241,乳胞素+VCR组为0.086。分析结果提示乳胞素+VCR组的bcl?2 mRNA水平比其他组有明显下降。

    2.3  各组HepG2细胞凋亡率对照组、VCR 16h组及乳胞素+VCR组的细胞凋亡率分别为4.1%、53.4%及87.6%。经χ2检验： P<0.01，各组间凋亡率差异有非常显著性。

    3  讨论

    泛素通路是真核细胞内主要的蛋白质降解系统。泛素表达于所有的真核细胞中，在ATP存在时,泛素与细胞内的底物蛋白共价结合(蛋白质的泛素化),通过一系列酶联反应，最后将需降解的蛋白提呈给蛋白酶体（proteasome）而降解。细胞内产生的异常蛋白和短寿命蛋白大部分是通过该途径降解的。蛋白质的泛素化不仅是蛋白质的正常生理更新所需，而且也可作为细胞内监视系统的一部分，研究显示泛素通路是细胞凋亡调控的主要机制之一[4]。

    为了阐明VCR诱导的HepG2细胞自噬性凋亡过程中泛素通路的有关变化，作者在已建立的VCR诱导HepG2细胞自噬性凋亡之细胞模型［2］基础上进行了上述实验。本研究结果显示VCR处理后HepG2细胞中泛素含量增加,而泛素表达水平的提高有利于待分解的蛋白质泛素化，说明有更多的蛋白质与泛素结合而被降解。有认为泛素通路对一些底物的降解可以引起一些凋亡因子从线粒体释放，进而激活caspase蛋白酶家族[5]。本实验中的HepG2细胞泛素表达水平增高是与VCR诱导的HepG2细胞自噬性凋亡有关的，提示泛素依赖的蛋白质降解途径也是自噬性凋亡过程中一些蛋白质降解的一种途径，泛素可能是凋亡的一个蛋白标记物。

    在正常活细胞，泛素化的蛋白质可以很快地被蛋白酶体降解，所以，在凋亡细胞中泛素?蛋白质结合物的聚集可能与蛋白酶体功能的障碍有关。蛋白酶体既可以促进细胞生存，也可以促进细胞凋亡，这与细胞的增生状态，受损程度、细胞类型特异性等有关。蛋白酶体活性的抑制可促进生长活跃的细胞凋亡，但是不触发静止的分化的低增殖指数的细胞凋亡［5］。本实验结果显示：加用蛋白酶体特异抑制剂乳胞素后的乳胞素+VCR组的细胞凋亡率明显比单用VCR组高，说明对蛋白酶体功能的抑制可以促进VCR诱导的HepG2细胞自噬性凋亡。

    泛素通路涉及凋亡调控的详细机理尚不十分清楚，阻断泛素通路可以导致几乎所有bcl?2蛋白均被caspase?3特异性酶解，提示泛素通路以某种潜在的机制参与了对bcl?2蛋白的调控。有研究发现在某些肿瘤细胞系中蛋白酶体的抑制剂可诱导这些细胞发生凋亡 [6]。从本研究结果中可见加用乳胞素后bcl?2的表达比单用VCR组的bcl?2表达更减少、细胞凋亡率更高，可能的解释是泛素通路参与了对bcl?2蛋白的调控，泛素通路被阻断后通过某种机制使caspase?3迅速被激活，而致bcl?2被特异性酶解掉所致。Cheng等[7]最先发现并报道了bcl?2环区的天冬氨酸(ASP34)是caspase?3的酶解位点。bcl?2的裂解先于其他已知半胱天冬酶?3底物如PARP的裂解，提示bcl?2的裂解在凋亡级联的反应中是一个相对早期的事件。

    关于凋亡调控机制中两个关键性蛋白—Caspase?3和bcl?2之间如何相互作用的详细生化过程是凋亡信号传导研究中的主要热点问题之一。进一步研究还发现bcl?2蛋白是通过抑制线粒体膜的通透性和阻止细胞色素C的释放而发挥抗凋亡作用的[6]。这些方面的研究在作者系列研究的其他部分也有涉及。

    作者的以上实验证实了经VCR处理后HepG2细胞中泛素含量增加，提示泛素通路也是VCR诱导的HepG2肝癌细胞自噬性凋亡过程中一些蛋白质降解的一种途径。对蛋白酶体功能的抑制可以促进HepG2肝癌细胞的自噬性凋亡，在此凋亡过程中泛素通路参与了对bcl?2蛋白的调控。

【】
  ［1］ Yang Y,Yu X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way[J].The FASEB Journal, 2003,17(8):790?799.

[2] 彭心昭，陈英，朴英杰，等.长春新碱诱导的自噬性细胞凋亡对线粒体膜电位的影响[J].医学物杂志,2001，18（1）：37?39.

[3] Leitch V, Agre P, Landon S,et al. Altered ubiquitination and stability of aquaporin?1 in hypertonic stress[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(5): 2894?2898.

[4] Roos MP, Sistonen L.The ubiquitin?proteasome pathway[J]. Ann Med, 2004,36(4):285?295.

[5] Lee JC, Peter ME.Regulation of apoptosis by ubiquitination[J]. Immunol Rev,2003,193(1):39?47.

[6] Almond JB, Cohen GM.The proteasome: a novel target for cancer chemotherapy[J]. Leukemia, 2002,16(4):433?443.

[7] Cheng EH?Y,Kirsch DG. Conversion of bcl?2 to a bax?like death effector by capases[J].Science,1997,278(5345):1966?1968.