顺铂对人鼻咽癌CNE?2Z细胞端粒酶活性和细胞周期及凋亡的影响

【摘要】  目的 研究顺铂对人鼻咽癌CNE?2Z细胞端粒酶活性、细胞周期及凋亡的影响，以探讨顺铂诱导CNE?2Z细胞凋亡与端粒酶活性水平的关系以及顺铂诱导鼻咽癌细胞凋亡的可能机制。方法 分别以不同的药物浓度作用于体外培养的CNE?2Z细胞不同的时间，用TRAP?ELISA的方法定量检测CNE?2Z细胞在顺铂处理前后的端粒酶活性水平，同步进行细胞形态观察，流式细胞仪分析细胞周期的改变并检测凋亡。结果 CNE?2Z细胞端粒酶呈阳性。用不同浓度的顺铂不同的时间作用于CNE?2Z细胞，结果细胞周期被阻滞在G1期，出现细胞凋亡，下调端粒酶活性，且呈时间依赖性及剂量依赖性。结论 化疗药物顺铂可能是通过改变细胞周期分布（G1期阻滞）并同时诱导细胞凋亡、下调其端粒酶活性而发挥抗癌作用的，故可将化疗前后细胞端粒酶活性的变化作为鼻咽癌化疗敏感性指标之一。

【关键词】  端粒酶；鼻咽肿瘤；顺铂；凋亡

    Effect of Cisplatin on Telomerase Activity and Cell Cycle and Apoptosis in Human Nasopharyngeal Carcinoma CNE?2Z Cells  

     Key words：Telomerase；Nasopharyngeal neoplasm；Cisplatin；Apoptosis

    近来研究发现，端粒酶的活化可以避免端粒的缩短，从而使细胞成为永生化细胞或无限增殖的肿瘤细胞，通过抑制端粒酶的活性可以抑制肿瘤细胞的生长,可增加整个基因组的不稳定性或使细胞的增殖向分化、衰老和凋亡方向转变[1?4]。因此，我们采用TRAP—ELISA法定量检测CNE?2Z细胞用顺铂处理前后的端粒酶活性，并同步检测细胞周期变化和凋亡。

    1材料与方法

    1.1材料

    1.1.1细胞培养  鼻咽癌细胞系CNE?2Z为本室保存。设立实验组和对照组，两组癌细胞同时传代，实验组于传代培养24h后加入工作浓度的顺铂，继续培养24h、48h、72h后收集细胞。

    1.1.2药品和试剂  顺铂为齐鲁制药厂产品，工作浓度为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L[5，6]。Telomerase PCR?ELISA检测试剂盒为德国Boehringer Mannhein公司产品。DEPC、牛血清白蛋白购自上海华舜生物工程有限公司。考马斯亮兰G?250购自Sigma公司。

    1.2实验方法

    1.2.1细胞形态观察定时在倒置显微镜下观察细胞形态。各组细胞取适量，加入荧光染料Hoechst33258及PI至终浓度分别为10μg/ml、20μg/ml，37℃避光30min，紫外光激发，荧光显微镜下观察细胞。细胞经Hoechst 33258/PI双重染色后，在荧光显微镜下经紫外光激发，发出粉红色荧光，染色质聚集呈不均匀块状的细胞为凋亡细胞；发出蓝色荧光且染色质分布均匀的为活细胞。

    1.2.2流式细胞仪分析  各组细胞各取1×105个细胞，调成细胞悬液，加PBS 0.3ml用RNA酶A 37℃处理细胞30min，加300μl PI染15min，350目筛网过滤后用流式细胞仪检测凋亡细胞含量。如细胞凋亡发生时其小分子量DNA从细胞中丢失，使凋亡细胞的DNA含量降低而导至荧光染料对其可染性降低，在G0/G1期峰前出现亚二倍体峰（亚G1峰或凋亡峰）。

    1.2.3DNA片段分析各组细胞经50μl裂解液处理细胞10s，1 500g×5min。移上清至另一微量加10μl 10% SDS，2μl RNAase A，混匀，37℃水浴2h，加70μl 10M NH4Ac，600μl无水乙醇沉淀DNA，4℃，1 500g×15min，去上清，70%乙醇洗一次，真空抽干。加入40μl TE 溶解沉淀DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳。细胞出现凋亡时，凋亡细胞的DNA降解后，在琼脂糖凝胶电泳带上可呈现梯状条带。

    1.2.4端粒酶活性检测

    1.2.4.1细胞TLMA蛋白的提取 收集癌细胞，制备TLMA提取液[1]。并用考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量。

    1.2.4.2TRAP?ELISA检测 取TLMA蛋白提取液1～5μl，阳性对照（试剂盒提供）2μl ，阴性对照（阳性对照65℃加热10 min）2μl（蛋白含量均为50μg），加入25μl TRAP?PCR扩增液和无菌DEPC水50μl混匀，PCR扩增。取上述PCR扩增产物5μl 加变性液20μl 混匀，置室温10min，加入杂交液225μl 混匀后取100μl 包被于预冷的抗地高辛酶标板中，37℃，300rpm孵育2h，2 000g，离心，加入100μl 过氧化物酶，18℃～22℃，300rpm孵育30min，加入100μl TMB底物显色液，18℃～22℃，300rpm孵育15min，终止反应；用酶标仪测其在波长450nm的吸光度A值。

    1.3结果判断阳性反应阈值为A≥0.2[7]

    1.4统计学分析数据资料用SPSS10.0统计软件作t检验。

    2结果

    2.1细胞形态观察倒置显微镜下观察显示，5μmol/L和10μmol/L的顺铂分别作用于CNE?2Z细胞24h未见异常，细胞经Hoechst 33258/PI双重染色观察无凋亡，作用48h、72h后可发现贴壁的多边形细胞变圆，细胞体积缩小、皱缩，双染可见少量的细胞出现凋亡。20μmol/L的顺铂作用于CNE?2Z细胞24h、48h、72h后可发现随着处理时间的延长，细胞出现的主要病理变化为贴壁的多边形细胞变圆，细胞体积缩小、皱缩，部分细胞脱落。Hoechst 33258/PI双染可见较多的细胞出现凋亡,见图1。

    2.2流式细胞仪检测细胞周期和凋亡   

    5μmol/L顺铂作用于CNE?2Z细胞24h未检测到细胞周期阻滞和凋亡。5μmol/L顺铂作用于CNE?2Z细胞48h、72h可检测到凋亡但无明显的细胞周期阻滞现象（P＞0.05）。10μmol/L的顺铂作用于CNE?2Z细胞24h、48h、72h均可检测到凋亡但也无明显的细胞周期阻滞现象（P＞0.05）。20 μmol/L的顺铂作用于CNE?2Z细胞24h、48h、72h后均可检测到明显的凋亡（P＜0.05）和细胞周期阻滞现象（P＜0.05），细胞被阻滞在G1期。

    2.3端粒酶活性水平检测结果

    5μmol/L和10μmol/L的顺铂分别作用于CNE?2Z细胞24h、48h、72h后端粒酶活性均有下降，与对照组比较没有显著性差异(P＞0.05)；20μmol/L的顺铂作用于CNE?2Z细胞24h、48h、72h后可发现，随着处理时间的延长，端粒酶活性显著下降，与对照组比较有显著性差异(P＜0.05),见图2。

    3讨论

    端粒是真核染色体末端的特殊结构，由富含G的DNA重复序列及相关蛋白组成，有防止染色体降解、缺失、重排及端端融合的作用。端粒随细胞分裂而缩短，最终导致末端功能丧失和染色体失稳造成细胞衰老死亡。端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的逆转录酶。其作用是在复制期（S期）的线性染色体末端添加TTAGGG重复片段，以弥补染色体由于细胞分裂所出现的末端进行性缩短，从而使细胞无限增殖，导致肿瘤的发生和细胞永生化。大多数的研究表明，人类多种肿瘤端粒酶阳性，这些肿瘤缺乏调节端粒酶的机制，不能下调端粒酶活性使细胞停止分裂和退出细胞周期。端粒酶活性的调节可能是肿瘤作用机制的一部分［8］。

    众所周知，在适当的有丝分裂源刺激下，细胞离开静止期，进入细胞周期中的G1初期，细胞通过位于G1晚期的限制点后，进入DNA合成的S期，并经G2期后分裂成两个子细胞（M期），再进入下一次细胞增殖周期。子细胞可以有继续增殖、暂不增殖和不增殖等三种前途。影响细胞周期的任何一个阶段，都能够将细胞终止于细胞周期中的某一阶段，从而影响细胞的生长，达到抑制其增殖的目的。进入细胞周期的细胞也可以发生凋亡而离开细胞周期［9］。

    有学者认为［6］，细胞凋亡是基因控制下的细胞自我消亡过程，凋亡受阻是包括肿瘤在内的多种人体疾病的重要发病机制，因此诱导肿瘤细胞凋亡成为当今肿瘤治疗研究的热点，不同的肿瘤细胞有不同的凋亡域，关键是如何提高肿瘤细胞对药物的敏感性，并诱导细胞进入凋亡，这是肿瘤治疗取得成功的关键之一。抗癌药顺铂是DNA合成（S期）抑制剂，是临床常用于治疗晚期鼻咽癌患者的主要化疗药物。本实验用不同浓度的顺铂不同的时间作用于CNE?2Z细胞，结果端粒酶活性均不同程度地受到抑制，细胞形态发生改变，细胞周期被阻滞在G1期，出现细胞凋亡，且呈时间依赖性及剂量依赖性。

    本实验结果提示，顺铂可能是通过改变细胞周期（G1期阻滞）并同时诱导细胞凋亡、下调其端粒酶活性来发挥抗癌作用的，因此我们认为化疗前后细胞端粒酶活性的变化可以作为鼻咽癌化疗敏感性指标之一。

【】
  ［1］Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer［J］.Science,1994,266 (5193)：2011?2015.

[2]Feng J，Funk WD，Wang SS，et al.The RNA component of human telomerase［J］.Science，1995，269(5228)：1236?1241.

[3]Kondo S，Taoaka Y，Kondo Y，et al.Antisense telomerase treatment：induction of two distinct pathways，apoptosis and differentiation［J］.FASEB J，1998，12(10)：801?811.

[4]Bodbar AG，Ouellette M，Frolkis M，et al.Exlension of life?span by introduction of telomerase into normal human cells［J］.Science，1998，279(5349)：349?352.

[5]陈于法，郑树，陈丽荣，等.紫杉醇诱导人乳腺癌细胞凋亡过程DNA甲基化水平检测［J］.肿瘤,1999,19（2）: 65?68.

[6]何冬梅，张洹.端粒酶活性的抑制对顺铂诱导HL?60细胞凋亡的影响［J］.实验血液学杂志,2001,9（3）: 215?219.

[7]卫立辛，郭亚军，闫振林,等.检测人端粒酶活性的端粒酶TRAP?ELISA法的建立［J］.中华肿瘤杂志，1998，20（4）: 264?266.

[8]Kim NW.Clinical implications of telomerase in cancer［J］.Eur J Cancer,1997,33(5):781?786.

[9]蒋季杰、范亚平.肾病学[M].北京：人民军医出版社，2001.313?314.