复方大果木姜子软胶囊抗流感病毒作用的体外实验研究
作者：胡万福，张永萍，邱德文
【关键词】 复方大果木姜子软胶囊；,,FM1；,,MDCK；,,抑制病毒增殖；,,抗病毒活性
摘要：目的对复方大果木姜子软胶囊进行体外抗流感病毒实验研究，开发安全有效的抗流感病毒的中药新药。方法细胞培养实验方法。结果复方大果木姜子软胶囊在MDCK细胞中的半数中毒浓度（TC50）为1.248 mg・ml-1；预防组抗流感病毒的半数有效浓度（EC50）为0.117 mg・ml-1；指数（TI）为10.67；感染病毒0~7 h后均有明显的抑制FM1在MDCK细胞中增殖的作用。结论复方大果木姜子软胶囊对流感病毒FM1在MDCK细胞中的增殖具有明显的抑制作用。
关键词：复方大果木姜子软胶囊； FM1； MDCK； 抑制病毒增殖； 抗病毒活性
Anti-influenza Effect of Fufang Daguomujizngzi Ruanjiaonang in vitro
Abstract：ObjectiveTo observe the effect of anti-virus by compound-herbs china momum migao H.W.Li soft capsule,to develop an effective new drug of anti-virus.MethodsThe cell culture experiment.ResultsIt was found to be a potential inhibitor of influenza FM1 virus in a concentration-dependent manner with a TC50of 1.248 mg・ml-1 in MDCK culture. The EC50 was 0.117 mg・ml-1(TI=10.67) when drug was added for 0~7 hours after virus infection. ConclusionThere might be a quantity-effect relationship and it has notable restrain effect.
Key words：China momum migao H.W.Li soft capsule; FM1; Restrain clone of virus; Anti-virus activity
流感病毒易引发急性呼吸道疾病，不仅影响人们的正常生活，还容易引发严重的并发症。由于其表面抗原能经常不断发生变异，使本来有效的流感病毒疫苗很快失效［1］。当前用于防治流感的药物主要以化学合成药物为主，如金刚烷胺（Amantadine）、金刚乙胺（Rimanta-dine）和扎那米韦（Zanamivir）等，分别存在有毒副作用和服用不方便的问题［2~4］，因此，研制开发抗流感病毒的低毒有效的中药制剂势在必行。现有的研究表明，大果木姜子具有增加血液循环、改善心肌缺血［5~7］、抗流感病毒［8］等作用。复方大果木姜软胶囊是以大果木姜子为主要原料，经提取各味药材的有效部位制成的软胶囊剂。本研究采用细胞培养技术对复方大果木姜子软胶囊中药物有效部位抗流感病毒FM1活性进行了研究。现将实验结果报道如下。
1 材料及方法
1.1 药品及试剂复方大果木姜子软胶囊（自制，批号20050120）；MEM培养液（购于GIBCO公司，批号1284573）；胰酶（购于GIBCO公司，批号BE2189）；新生牛血清（购于杭州四季青生物制剂公司，批号040624）；流感病毒亚甲型FM1（H1N1）、MDCK细胞（均由贵阳医学院组织工程与干细胞实验中心提供）。
1.2 细胞培养
1.2.1 病毒血凝滴度测定按常规操作将病毒接种于9~11 d胚龄鸡胚的尿囊液，测定红细胞凝集活性，得病毒血凝滴度≥640，细菌培养阴性，分装，置-85℃保存待用。
1.2.2 MDCK细胞培养MDCK细胞采用单层接种培养，培养液为含10%新生牛血清的MEM培养液（含1×105 u・L-1青霉素，100 mg・L-1链霉素，0.2% heps,0.2% NaHCO3），37℃，5% CO2培养箱中培养。
1.3 病毒在MDCK细胞中毒力测定用含2%新生牛血清的MEM将病毒稀释成10，102，103，104，104，105，106，107，108，109，1010倍10个浓度，按常量分别加入已长成单层细胞的96孔细胞板中，置于37℃、5%CO2温箱内孵育2 h，弃去含病毒维持液，更换正常细胞培养液，继续培养，分别于1，2，3，4，5，6，7 d在倒置显微镜下观察记录细胞病变（CPE）程度。同时设正常细胞对照。细胞半数感染量（TCID50）。经测定，FM1感染MDCK细胞的TCID50是107.5/0.1 ml。
1.4 复方大果木姜子软胶囊对MDCK的毒性检测取对数生长期的MDCK细胞接种于24孔细胞培养板，37℃，5%CO2的培养箱中培养24 h后先以不同稀释浓度的药物作用2 h，然后用Hank’s液洗板3次，甩干后每孔加1 ml含2%新生牛血清MEM维持液维持生长，于37℃，5%CO2的培养箱中培养。具体分组及药物分布如表1所示：
表1 复方大果木姜子软胶囊对MDCK细胞毒性检测（略）
其中，ABCD表示分组，“一”表示正常对照，2~6组为药物稀释浓度观察7 d内细胞CPE变化，可得：0.624 mg・ml-1稀释浓度时，药物对MDCK细胞无毒（如图1所示），因此选择此浓度作为药物作用于MDCK细胞的给药起始浓度。
1.5 复方大果木姜子软胶囊对FM1的预防作用实验取对数生长期的MDCK细胞接种于24孔板中（每孔约含细胞1×104个），37℃2，5%CO2培养箱中培养24 h后加入不同浓度的药物稀释液（以含2%新生牛血清的MEM溶解稀释，终浓度为0.078 mg・ml-1），每板设4个浓度梯度、1个病毒对照和1个正常对照，各设4个平行孔。先以药物稀释液作用于细胞1 h，以Hank’s液洗涤2次，然后再以病毒液作用2 h，以Hank’s液洗涤3次，最后用含2%新生牛血清的MEM维持液在37℃，5% CO2培养箱中培养。分别在培养后1，2，3，4，5，6，7 d时在倒置显微镜下观察细胞CPE变化，验证药物对FM1预防作用。
1.6 复方大果木姜子软胶囊对FM1的治疗作用实验方法同1.5预防组实验，先以病毒攻击细胞，再用药物作用细胞，观察细胞CPE变化，验证药物对FM1的治疗作用。
1.7 复方大果木姜子软胶囊与FM1同时作用于MDCK细胞的实验方法同1.5预防组实验，以病毒和药物同时作用细胞。观察细胞CPE变化，验证药物对FM1的治疗作用。
2 结果
2.1 复方大果木姜子软胶囊对MDCK细胞感染FM1的预防作用当药物浓度达到0.078 mg・ml-1时，镜下观察可以看到各浓度中细胞生长呈不同程度完整，最小稀释浓度约有75%细胞完整（如图2示）。结合细胞抑制率，经 execl统计处理可得其半数有效浓度（EC50）为0.117 mg・ml-1,治疗指数（TI）为10.67，且预防作用随浓度变化和时间变化而变化，呈现明显的时-效和量-效关系。同时未见大面积的细胞病变，表明复方大果木姜子软胶囊对FM1具有良好的预防作用。
a-0.312 mg・ml-1浓度下细胞CPE变化 b-0.624 mg・ml-1浓度下细胞CPE变化 c-正常细胞
图1 复方大果木姜子较胶囊MDCK细胞毒性作用（略）
a-0.078 mg・ml-1浓度下细胞CPE变化 b-病毒细胞CPE变化 c-正常细胞
