乳腺癌HER-2/neu基因扩增与临床病理因素的关系
【摘要】 目的：观察乳腺癌HER-2/ neu基因扩增情况及与某些预后因素之间的关系。方法：利用显色原位杂交（chromogen in situ hybridization，CISH）技术检测石蜡包埋的乳腺癌组织切片中HER-2/neu基因扩增情况，采用免疫组织化学（immuno-histochemistry ，IHC）法观察CD34标记的乳腺癌组织中的新生血管, 光学显微镜下计数微血管密度（microvessel density，MVD）。结果：30例标本中HER-2/ neu基因扩增的11例，HER-2/neu基因扩增与患者年龄、肿瘤大小、组织分级及淋巴结状况均不相关，与MVD相关。结论：HER-2/ neu基因扩增与肿瘤血管生成关联，HER-2/ neu基因水平与MVD在乳腺癌的预后判断上具有一致性。
【关键词】 乳腺癌 HER-2/neu基因 显色原位杂交（CISH） 微血管密度
乳腺癌已成为当今危害女性健康第一位的恶性肿瘤，虽然普遍采取的综合包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗及其他生物治疗能够延长部分患者的无病生存期和总生存期，但仍有近55%的患者在五年内出现复发、转移，近14%的患者在五年内死于肿瘤的演进。作为乳腺癌预后的判断指标除了原癌基因HER-2/neu外，还包括肿瘤大小、腋窝淋巴结有无转移、组织学分级、有无脉管浸润、肿瘤类型和雌、孕激素受体状态等。尽管腋窝淋巴结有无转移仍然是最重要的预后判断指标，但现有很多研究表明MVD是肿瘤血管生成的标志物，特别是在乳腺癌和肺癌中，它比其它类型标志物预测肿瘤转移甚至病人的预后更有意义；许多研究也显示MVD可以作为浸润性乳腺癌的预后指标，在乳腺癌的早期阶段测定MVD不但可以更加全面准确的判断乳腺癌病人的预后和指导接受合理的辅助化学药物治疗，而且可以为将来应用特异性抗血管生成分子靶向药物的使用提供客观的依据[1]。
本研究基于原癌基因HER-2/neu和肿瘤微血管密度都可作为重要的判断乳腺癌病人的预后和分子靶向药物应用的特异性靶点出发，利用CISH法检测HER-2/neu基因扩增以及IHC测定肿瘤微血管密度，旨在探讨HER-2/neu基因扩增与乳腺癌的肿瘤大小、淋巴结有无转移、组织学分级以及与肿瘤微血管密度状态等有无相关性，并希望初步了解HER-2/neu的基
因水平和肿瘤微血管密度状态对乳腺癌的预后判断有无一致性，以便为今后乳腺癌分子靶向药物治疗和预后判断提供理论依据和方法。
1 材料与方法
1.1 资料来源
收集2001年～2005年解放军三零七行改良根治术的30例乳腺癌手术标本。患者术前均未接受任何治疗，年龄30-68岁，平均51岁。经病理确诊浸润性导管癌27例，浸润性小叶癌3例，有淋巴结转移的17例。肿瘤直径＞2cm的25例，直径≤2cm的5例。病理组织学分级按改良Bloom及Richardson标准执行[2]，Ⅰ级4例，Ⅱ级15例，Ⅲ级11例。标本采用10%福尔马林固定，石蜡包埋，组织切片厚度为5μm。
1.2 试剂与方法
地高辛标记的HER-2/neu原癌基因原位杂交探针和放大系统检测试剂盒（HER-2 CISHTM）及单克隆抗CD34抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。具体操作按说明书进行。每批实验均用已知阳性片做阳性对照，用TBS取代探针及一抗做阴性对照。
1.3 结果判定
HER-2/neu基因判断为扩增的标准是：光镜×40倍的视野下超过50%的癌细胞核内见到成簇、成粗颗粒或大于10个点的棕色信号。（见图1）
微血管密度（MVD）的计数方法是：目前微血管计数多采用Weidner等[3]的校正技术，先在低倍镜下寻找新生血管最密集区即“热点”（hotspot），然后在高倍镜下观察染成棕色的单个细胞和细胞丛，并以此作为一个血管，血管腔和腔内的红细胞不作为计数条件，以5个视野血管的均数表示血管数。与抗体起反应的巨噬细胞和浆细胞应在镜下根据形态学差异予以排除。凡血管腔直径大于8个红细胞或血管壁带有明显的肌层以及纤维硬化、炎症及坏死区的均不能计入总数[4]。
1.4 统计学方法
HER-2/neu基因扩增情况与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结有无转移及组织学类型关系的定性资料用校正的X2检验，与微血管密度的关系用t检验，数据统计分析由SPSS12完成。
2 结果
2.1 乳腺癌组织内微血管的分布
肿瘤内微血管分布不均，形态不规则，数量相差悬殊。癌巢周边区血管明显较中央区多，部分肿瘤可在癌巢边缘见到成串的新生血管环（见图2）。
图2 癌细胞巢边缘可见成串的新生血管（×10倍）
2.2 HER-2/neu基因状况与MVD的关系
HER-2/neu基因扩增组的MVD值高于HER-2/neu基因无扩增组，P＜0.05，两组间的差别有统计学意义（见表1）。 表1 HER-2/neu基因状况与MVD测定结果（个/200倍视野，
2.3 HER-2/neu基因状况与临床病理因素的关系
HER-2/neu基因状况在患者年龄、肿瘤大小、组织学分级及淋巴结状况不同分组间的差别无统计学意义，P＞0.05，（见表2）。表2 HER-2/neu基因状况与临床病理因素的关系
3 讨论
HER-2/neu基因又称c-erbB-2基因，编码相对分子量185KDa具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白（p185或HER-2/neu蛋白）。HER-2/neu蛋白属于表皮生长因子受体家族成员，在细胞信号传导中发挥重要作用，是细胞增殖、分化、移动和存活的重要调节因子。HER-2/neu蛋白过表达与肿瘤进展快、易复发，患者无瘤及总生存期短[5]密切相关。Slamon等[6]研究发现近25%～30%的乳腺癌患者可见HER-2/ neu基因的扩增，激活后的HER-2/ neu基因表现为数量上的扩增，并无基因的突变。HER-2/neu蛋白过度表达的乳腺癌中，90%以上具有基因扩增，表明基因扩增是多数乳腺癌HER-2/neu蛋白过度表达的前提[7]。然而世界卫生组织曾在北美、欧洲对300例HER-2/neu的基因和蛋白检测结果进行比较，证实免疫组化的假阳性率在20%以上，因此通过FISH或CISH对乳腺癌患者HER-2/neu基因水平做出准确的检测将随着Herceptin的深入应用越来越多地被开展。本实验结果显示：①30例乳腺癌中出现HER-2/neu基因扩增为11例，19例为无扩增，HER-2/neu基因扩增率约为36.7％，这一结果高于报道的HER-2/neu基因扩增率25～30％，考虑应和本实验的样本数较少有关，待远期收集大量样本的实验结果后再做确证；②HER-2/neu基因有否扩增，与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移以及组织学分级均无关，这与以往文献报道有很大不同，[8]有学者认为HER-2/neu的表达与临床分期、淋巴结转移、组织学分级是显著相关的。出现差异的原因考虑有以下两个方面：（i）实验的样本数较少，可能无法充分反映HER-2/neu基因扩增情况在各种患者中的分布趋势；（ii）对HER-2/neu检测的水平不同，既往用免疫组化方法检测的是HER-2/neu蛋白水平，而本实验中采用CISH方法检测的是HRE-2/neu核酸水平，两者的表达情况可以不完全相同。笔者认为肿瘤细胞中HER-2/neu在从基因扩增到蛋白过表达的过程中并非完全是依次对应发生的，而且基因扩增和蛋白过表达在肿瘤细胞恶性生物学表型中所发挥的作用是不一样的，蛋白水平所影响的反应更广泛，因此更容易与某些临床病理因素建立相关性。对于HER-2/neu基因扩增却无相应蛋白过表达及HER-2/neu蛋白过表达却无基因扩增的病例，其发生机制及意义尚有待于细胞和分子生物学领域的进一步探讨。③Toi发现微血管计数与EGFR、HER-2有密切关系，他们认为EGFR和HER-2蛋白共同表达，提示乳腺癌病人预后不良[9]。Petit等在体内外实验中发现HER-2蛋白表达，可以影响血管内皮生长因子诱导肿瘤的新生血管形成[10]。本实验的结果与以上研究结果基本一致，HER-2/neu基因扩增组的MVD值明显高于HER-2/neu基因无扩增组。根据本实验结果可以推测，HER-2/neu基因扩增与HER-2/neu蛋白过度表达一样，可以作为乳腺癌预后不良判断的一个独立指标，乳腺癌原癌基因HER-2的扩增水平和肿瘤微血管密度状态对乳腺癌的预后判断具有一致性。此外，笔者根据本实验的结果推测肿瘤诱导血管生成除了HER-2/neu蛋白活化上调某些血管生成因子的途径外，有可能在HER-2/neu基因扩增的同时也伴随着某些血管生成因子基因的转录活化或增强，因此仅靠Herceptin阻断HER-2/neu蛋白通路抑制血管生成是不够的，虽然目前贝伐单抗联合曲妥珠单抗应用尚在研究之中，但相信不久这两种靶向药物的联合应用在乳腺癌的中会迎来令人振奋的结果。
【文献】
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