骨肉瘤中Survivin与Caspase?3的表达及其相关性研究
作者：王玉峰，王岩峰，邴佩旭，祝勇
【摘要】 ［目的］探讨Survivin、Caspase?3在骨肉瘤中的表达及其与细胞凋亡的关系。［方法］采用免疫组化法检测骨肉瘤及正常骨组织中Survivin和Caspase?3的表达，运用TUNEL方法检测细胞的凋亡。［结果］在77％的骨肉瘤组织中Survivin阳性表达，显著高于正常组织；Caspase?3蛋白在骨肉瘤和正常组织中的阳性表达率分别为65％和89％，差异有显著性；在骨肉瘤中，Survivin和Caspase?3的表达呈负相关；Survivin呈阳性的骨肉瘤中细胞凋亡指数明显低于Survivin呈阴性组（P＜0.01）；Caspase?3呈阳性的骨肉瘤中细胞凋亡指数明显高于Caspase?3呈阴性组（P＜0.01）。［结论］Survivin、Caspase?3参与了骨肉瘤的，Survivin可能通过抑制Caspase?3的活性从而发挥其抑制骨肉瘤细胞凋亡作用。
【关键词】 骨肉瘤； Survivin; Caspase?3; 凋亡
Abstract：［Objective］To investigate the relationship between Survivin,Caspase?3 and cell apoptosis in osteosarcoma.［Method］The expression of Survivin and Caspase?3 in osteosarcoma were detected by immunohistoehemistry.The apoptosis of osteosarcoma cell was assessed by terminal deoxynucleotide transferase mediated dUTP nick end labeling（TUNEL）.［Result］The results showed that Survivin expression was detected 77% in osteosarcoma tissues and was significantly higher than in the normal tissues.Caspase?3 was detected in 26 of 40（65%）osteosarcoma tissues and in 34 of 38（89%）in normal bone tissues,with significant difference（P＜0.05）.Survivin expression in osteosarcoma tissues was inversely related to Caspase?3 expression.Average apoptosis index of Survivin positive osteosarcoma tissues group was significantly lower than that of Survivin negative group.Average apoptosis index of Caspase?3 positive osteosarcoma tissues group was significantly higher than that of Caspase?3 negative group.［Conclusion］Survivin,Caspase?3 play an important role in the progress of osteosarcoma.Survivin exert probably the act of restraining osteosarcoma cell apoptosis by the pathway of Caspase?3.
Key words：osteosarcoma; Survivin; Caspase?3; apoptosis
骨肉瘤是源于间叶组织的恶性肿瘤，其发病率占骨肿瘤的20％，占恶性骨肿瘤的76.21％，具有好发于青少年，恶性度高，进展快，预后差等特点。随着近年来手术结合化疗等方法的进展，患者的5年生存率已有所改善，但仍低于60％。因此深入研究骨肉瘤的发生机理对提高其疗效具有重要意义〔1〕。在肿瘤的发展过程中存在着凋亡程序被抑制，细胞周期调控机理被破坏，从而导致恶性增生这一机理〔2〕。生存素Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protelns，IAP）家族成员之一。Caspase是在细胞凋亡中起关键作用的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶类，其中Caspase?3是凋亡触发过程中的关键效应分子。本研究对骨肉瘤Survivin、Caspase?3的表达及与细胞凋亡的关系进行探讨，为骨肉瘤的治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 标本及试剂
收集本院2000～2005年的骨肉瘤手术标本40例，男32例，女8例；年龄12～42岁，平均（18.5±0，5）岁。在骨肉瘤手术时，切取肿瘤组织3 g，正常骨组织3 g取自肿瘤骨段截的自体远端。鼠抗人Survivin单克隆抗体、Caspase?3抗体，SP免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒，TUNEL试剂盒等均购自博士德公司。
1.2 Survivin和Caspase?3的免疫组织化学检测
骨肉瘤和正常骨组织经包埋、切片、脱蜡至水，3％H2O2甲醇液作用阻断内源性HRP活性，抗原热修复后降至室温水洗，10％正常羊血清室温作用15 min，分别滴加Survivin和Caspase?3抗体，37 ℃温箱孵育60 min，PBS冲洗，滴加生物素标记的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗，加入辣根标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，二甲苯透明，封片。以PBS置一抗作为阴性对照，以已知阳性切片作为阳性对照。
1.3 TUNEL法对细胞凋亡的检测
除去Survivin和Caspase?3蛋白同时为阴性的骨肉瘤样本，连续切片，细胞或组织片固定，梯度乙醇处理，PBS浸泡，蛋白酶K处理标本，双蒸水洗涤，3％H2O2甲醇液消除内源性HRP，PBS中洗涤，1X TdT标记缓冲液孵育，TdT标记Biotin?dNTP，终止标记反应，PBS洗涤，DAB显色，去离子水洗涤，进行细胞凋亡的检测。
1.4 统计学方法
结果应用Image tool version 1.0软件分析，应用t检验、x2检验及等级资料相关检验（Spearman检验），P＜0.05时有统计学意义。
2 结 果
2.1 判定标准
免疫组化Survivin和Caspase?3的阳性反应产物呈棕黄色颗粒，主要定位于细胞浆（图1、2），依据Caspase?3阳性表达的着色深浅和阳性细胞数将表达强度分为4级：（-）无阳性反应或阳性细胞数＜25％；（+）阳性细胞≥25％～50%；（++）49％～75％的细胞显阳性；（+++）阳性细胞数＞75％。凋亡阳性细胞（TUNEL法）的细胞浆呈棕黑色（图3），凋亡指数AI（apoptosisi index，AI）为凋亡细胞与所有肿瘤细胞的比值。
40例骨肉瘤组织中，Survivin呈阳性检出的有31例，占77％；40例正常骨组织中Survivin阳性检出者5例，占13％，显著低于瘤组织（P＜0.05）。低分化肉瘤Survivin的表达率高于高／中分化肉瘤（P＜0.05）；在不同临床分期之间有显著性差异（P＜0.05），病理分级越高，Survivin的表达率越高。Caspase?3在骨肉瘤和正常组织中的阳性表达率分别为65％（26／40）和89%（34／38），二者之间有显著性差异（P＜0.05）。高、中分化的骨肉瘤组织中Caspase?3蛋白的阳性表达率明显低于低分化的骨肉瘤组，两者之间有显著性差异（P＜0.05）。
2.3 Survivin与Caspase?3表达的关系
在骨肉瘤组织，随着Survivin mRNA表达的升高，Caspase?3的表达随之降低，经Spearman相关检验，表明二者的表达呈负相关（r=-0.48，P=0.016）。
2.4 凋亡细胞的检测及AI值测定结果
TUNEL法所标记的细胞胞浆呈棕黑色，Survivin阳性的骨肉瘤组织组AI值为0.71％，显著低于Survivin阴性组（1.32％）（P＜0.05）；Caspase?3蛋白阳性的骨肉瘤组织组AI值为1.29％，明显高于Caspase?3蛋白阴性组（0.57％）（P＜0.05）。
3 讨 论
骨肉瘤（osteosarcoma）是源于间叶组织的恶性肿瘤，约占所有恶性骨肿瘤的20％，以产生骨样组织的梭形基质细胞为特征，恶性程度高，易早期肺转移，预后差。随着近年来对骨肉瘤发生机理的深入研究，已证实在正常骨细胞增殖和凋亡间保持着一种动态的平衡，该平衡有赖于癌基因、抑癌基因，以及某些调节肽等的调控，如平衡失控，肿瘤基因被激活而抑肿瘤基因被抑制，促使增殖加快，DNA损伤得不到修复，产生非整倍体，而凋亡机理被抑制，使细胞获永生，渐进性细胞周期调控机理的破坏则最终进展到癌〔3〕。
Survivin是新近分离鉴定的凋亡抑制基因，在人类大多数肿瘤组织中高表达，而在正常成人组织中弱表达，由于其独特的结构和分布而区别于其他凋亡抑制基因〔4〕。有研究表明Survivin不仅在恶性肿瘤中的表达明显高于正常组织，并且与肿瘤的分化程度密切相关〔5〕。Survivin蛋白是细胞周期G2／M期的重要调节因子，与其他细胞周期G2／M期检测点的调控基因具有协同作用，以保证细胞复制的忠实性。Survivin可能通过2条途径来抑制细胞凋亡：一是通过直接抑制凋亡终末效应器Caspase?3和Caspase?7的活性阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程；二是Survivin与细胞周期依赖性蛋白激酶CDK4结合，形成Survivin／CDK4复合物，使p21从与CDK4结合的复合物中释放出来，释放的p21易位到线粒体与pro Caspase?3形成复合物，抑制Caspase?3的活性从而抑制细胞凋亡〔6〕。本研究结果证实，骨肉瘤组织中Survivin阳性表达率高于正常组织。
Caspase?3又称Yama、apopain、CPP32。其主要作用是降解多ADP-核糖多聚合成酶（PARP），PARP的降解可导致核内核酸内切酶的激活，从而使核小体间DNA链水解断裂，产生凋亡所特有的DNA节段化。Caspase?3的活化主要有细胞外途径（Caspase?3途径/非线粒体依赖途径）和细胞内途径（Caspase?3途径／线粒体依赖途径），在凋亡过程中Caspase?3是关键的效应分子〔7〕。研究结果显示Caspase?3在骨肉瘤中的高表达，以及与骨肉瘤的分化密切相关，说明Caspase?3参与了骨肉瘤的形成，并且能够预示肉瘤的恶性程度。同时，通过对骨肉瘤组织中Survivin和Caspase?3的表达进行比较分析，作者发现在骨肉瘤中随着Survivin的表达率升高，Caspase?3的表达率则降低，二者的表达呈负相关。通过原位末端标记法（TUNEL法）检测骨肉瘤组织中肿瘤细胞的凋亡，作者发现：Survivin阳性的骨肉瘤组织中平均细胞凋亡指数显著低于Survivin阴性的骨肉瘤组织，Caspase?3阳性的骨肉瘤组织中平均细胞凋亡指数显著高于Caspase?3阴性的骨肉瘤组织，结果表明Survivin能抑制骨肉瘤细胞的凋亡，而Caspase?3可以直接诱导肿瘤细胞的凋亡，在肿瘤细胞凋亡中具有重要作用〔8〕。这说明Survivin至少通过部分抑制Caspase?3的活性，从而发挥其抑制细胞凋亡作用。
总之，Survivin通过部分抑制Caspase?3的活性抑制骨肉瘤细胞凋亡，从而使瘤细胞逃避凋亡，实现异常增殖，但其具体机理尚有待于深入研究。
【】
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