重组pcDNA3.1?hBMP?7真核表达载体的构建及转染兔骨髓基质干细胞的实验研究

【摘要】  构建人骨形态发生蛋白-7(human bone morphogenetic protein?7，hBMP?7)基因真核表达载体，评价其转染兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的诱导成骨能力。［方法］从人类胎盘组织中克隆出hBMP?7基因，与真核表达载体pcDNA3.1连接，成功构建了重组pcDNA3.1?hBMP?7真核表达载体；从兔骨髓中分离培养BMSCs，分为3组：A pcDNA3.1?hBMP?7转染组；B空载体pcDNA3.1转染组；C未转染组。使用RT?PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP?7在BMSCs中的表达。检测各组细胞碱性磷酸酶，胶原，骨钙蛋白合成情况。［结果］RT?PCR、免疫组织化学检测显示经hBMP?7转染的BMSCs中有BMP?7表达。经hBMP?7转染BMSCs的碱性磷酸酶于转染后第2 d显著增高，到第8 d达到最高;经hBMP?7转染的BMSCs合成胶原、骨钙蛋白能力也显著提高，与转染空载体、未转染的BMSCs相比有显著性差异(P<0.05)。［结论］成功构建了pcDNA3.1?hBMP?7真核表达载体;外源的hBMP?7基因可在兔BMSCs中充分、高效的表达，并且这种外源性hBMP?7基因具备了促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力，这为hBMP?7的基因提供了坚实的理论基础。

【关键词】  人骨形态发生蛋白?7 基因转染 骨髓基质干

    Abstract：［Objective］To construct arecombinant eukaryotic expression plasmid carrying human BMP?7 gene which was transfected into bone marrow stromal cells (BMSCs) in vitro and expressed.［Method］Clone human BMP?7 cDNA from a Chinese woman placenta was recombinanted with plasmid pcDNA3.1, to construct eukaryotic expression carrier of recombinaut pcDNA3.1?hBMP-7.The BMSCs were isolated from rabbit bone marrow and cultured in vitro.They were divided into three groups: pcDNA3. 1?hBMP?7 transduced group; pcDNA3.1 transduced group;untransduced group.The expression of hBMP?7 was detected by RT?PCR,Immuneohistochemistry. ALP, Collogen, Osteocalcin production were detected.［Result］The pcDNA3.1?hBMP?7 transduced BMSCs expressed hBMP?7 at both mRNA and protein levels.ALP activity was detected in pcDNA3.1?hBMP?7 transduced cells from day 2 to day 10,  peaking on day 8. Collogen,  osteocalcin production were elevated significantly too (P<0.05).［Conclusion］Eukaryotic expression carrier of recombinant pcDNA3.1?BMP?7 was constructed successfully.The results indicate that hBMP?7 is expressed in BMSCs sufficiently and is involved in inducing differentiation of BMSCs into osteoblast.The method would provide substantial basement for hBMP?7 gene therapy.

    Key words：hBMP?7;  genes transfection;  bone marrow stromal cells

     骨形态发生蛋白?7(BMP?7)诱导成骨的能力己得到广泛证实，在临床上用来促进骨折愈合，关节间融合和防止人工假体松动等方面有良好的应用前景。但仅靠外源性植入，BMP?7在骨损伤部位存在的时间及浓度是有一定限度的，往往不能满足某些骨损伤修复的需要。作者设想利用转基因技术将人BMP?7基因通过载体导入骨组织工程种子细胞(骨髓基质干细胞)，使种子细胞在骨损伤局部合成和分泌BMP?7实现其诱导成骨作用，促进骨损伤的修复。在本实验中作者构建了重组pcDNA3.1?hBMP?7真核表达载体，并且选择兔骨髓基质干细胞作为基因转染的靶细胞，对其合成表达外源性BMP?7及其促进骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力进行了检测，为今后将基因转移技术用于骨组织工程打下良好的基础。

    1  材  料

    1.1  菌株、质粒和动物

    感受态大肠杆菌JM 109购自Takara公司；pcDNA3.1真核表达载体购自Invitrogen公司；健康雄性新西兰大耳白兔(体重2 kg)由哈尔滨医科大学动物中心提供。

    1.2  工具酶和试剂盒

    限制性内切酶，T4DNA连接酶等均购自Takara公司；脂质体LipofectamineTM 2000转染试剂盒购自Invitrogen公司；反转录试剂盒购自Promega公司；碱性磷酸酶试剂盒、羟脯氨酸检测试剂盒购自武汉博士德公司。

    2  方  法

    2.1  重组pcDNA3.1?hBMP?7真核表达载体的构建

    2.1.1  人BMP?7基因的克隆(RT?PCR)  采用TRIzol试剂一步法提取人健康新鲜胎盘组织(哈尔滨医科大学附属二院妇产科提供)的总RNA，应用反转录的原理得到胎盘的cDNA。根据GeneBank中报告基因序列，设计合成扩增引物，其中BMP?7基因上游引物为：5?gtggtaccgatgcacgtgcgctcactg?3，引入Kpn Ⅰ酶切位点，下游引物为：5?agaagatctctcggaggagctagtggcag?3，引入Bg ⅠⅡ酶切位点；进行扩增反应(PCR扩增仪为BIO?RAD，美国伯乐公司。循环参数如下：94℃预变性4 min，94℃ 45 s，62℃ 60 s，72℃ 1.5 min，33次循环，最后72℃延伸10 min)。1％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

    2.1.2  pcDNA3.1?hBMP?7表达载体的构建和鉴定  取经Kpn Ⅰ、Bg ⅠⅡ双酶切的BMP?7片段及经Kpn Ⅰ和Bam Ⅰ双酶切的pcDNA 3.1片段加入T4DNA连接酶在16℃连接12 h。转化大肠杆菌，提取质粒行Kpn Ⅰ、Bam Ⅰ双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

    2.2  兔骨髓基质干细胞的培养

    兔耳缘静脉麻醉(2％戊巴比妥钠35 mg／kg)，双侧胫骨剪毛、碘伏消毒后应用16号骨穿针自胫骨粗隆部穿入骨髓腔，抽取2 ml骨髓加入200 U肝素抗凝。与淋巴细胞分离液混合，密度梯度离心，高速2 500 r／min、低速1 000  r／min后，吸取上层细胞层低速离心800 r／min，5 min弃上清后加入12％的胎牛血清(FBS)的全培养基，在5％CO2的培养箱中37℃培养原代，细胞数目为2×105个。

    2.3实验分组以及基因转染

    实验分组：A  pcDNA3.1?hBMP?7转染细胞组；B空载体pcDNA 3.1转染细胞组；C未转染细胞组。转染前1 d接种第2代骨髓基质干细胞(5×106)到60 mm3含无抗生素培养基的培养皿中。依据LipofectamineTM 2000试剂说明书转染BMSCs。

    2.4  RT?PCR检测外源基因的表达

    转染后的72 h用Trizol试剂盒提取各组细胞总RNA后，逆转录反应同前，取5 μl反转录产物及前述特异性引物对BMP?7基因进行PCR扩增。

    2.5  免疫组织化学检测外源基因的表达

    转染后72 h的BMSCs制备细胞爬片，培养3 d后，丙酮固定，使用链霉素生物蛋白?过氧化酶连接法进行免疫细胞化学反应，使用DAB显色。

    2.6  碱性磷酸酶(ALP)合成情况检测

    将各组细胞按2×104个／孔接种入24孔板，每组4个复孔。于0、2、4、6、8、10 d时，吸取细胞培养上清液应用碱性磷酸酶定量检测试剂盒进行检测。

    2.7  氯氨T法检测羟脯氨酸含量

    2周后将各组细胞按2×104个／孔接种入24孔板，每组4个复孔。用羟脯氨酸检测试剂盒进行检测。羟脯氨酸(mg／l)=测定管吸光度÷标准管吸光度×标准管浓度×稀释倍数。

    2.8  骨钙蛋白合成情况检测

    2周后将各组细胞按2×104个／孔接种入24孔板，每组4个复孔。吸取细胞培养上清液采用放射免疫测定的方法进行骨钙蛋白检测。

    2.9  统计学方法

    采用SPSSV 10.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，t检验比较不同组别的转染效果，P<0.05为有统计学意义。

    3  结  果

    3.1  pcDNA3.1?hBMP?7重组载体的双酶切鉴定

    凝胶电泳显示hBMP?7片段大小约为1.3 kb，连接产生的pcDNA3.1?hBMP?7质粒大小约为6.6 kb，经Kpn Ⅰ和Bam Ⅰ双酶切产生片段大小分别为5.3、1.3 kb，符合物理图谱，表明pcDNA3.1中已插入hBMP?7的cDNA序列，连接正确(图1)。

    3.2  RT?PCR法检测外源性BMP?7基因mRNA表达

    转染72 h后各组RT?PCR结果显示：hBMP?7转染组于1.3 kb处有特异性条带显示，空载体转染组和未转染组呈阴性，未检测出BMP?7 mRNA表达(图2)。

    3.3  免疫组织化学检测外源性BMP?7蛋白表达

    在pcDNA3.1?hBMP?7转染组细胞胞浆显示有棕色的颗粒出现(图3)。证实pcDNA3.1?hBMP?7真核表达质粒转染后可在兔骨髓基质干细胞表达BMP?7蛋白。

    3.4  碱性磷酸酶检测结果

    经转染BMP?7的BMSCs碱性磷酸酶活性于转染后第2 d显著增高(1.226 U／L)，到第8 d达到最高(1.560 U／L)，到第10 d仍持续增高(1.546 U／L)；而其他2组碱性磷酸酶活性基本保持不变(图4)。经转染BMP?7的BMSCs于各时间点ALP活性均高于其他2组，具有统计学意义(P<0.05)。

    3.5  氯氨T法检测羟脯氨酸含量

    经转染BMP?7的BMSCs羟脯氨酸合成量(11.400±1.680 mg／l)与转染空载体(6.060±0.614 mg／l)、未转染的BMSCs(5.600±1.630 mg／l)相比较有显著性差异(P<0.01)，证实经转染的BMSCs合成羟脯氨酸明显高于其它2组(图5)。

    3.6  骨钙蛋白检测结果

    转染BMP?7的BMSCs骨钙蛋白含量(1.078±0.127 ng／ml)与转染空载体(0.587±0.141 ng／ml)、未转染的BMSCs(0.502±0.121 ng／ml)相比较有显著性差异(P<0.05)，证实经转染的BMSCs合成骨钙蛋白含量明显高于其它2组(图6)。

    图1  pcDNA3.1?hBMP?7双酶切电泳图  M DNA marker 1 pcDNA3.1?hBMP?7  图2  pcDNA3.1?hBMP?7转染BMSCs后mRNA表达(RT?PCR)M DNA marker A pcDNA3.1?hBMP?7转染组 B 空载体pcDNA3.1转染组 C 未转染组  图3  经转染后BMSCs变成多角形，免疫组化可见细胞胞浆有大量棕色颗粒(×200)  图4  BMP?7基因转染对BMSCs碱性磷酸酶活性的影响  图5  BMP?7转染对BMSCs合成羟脯氨酸的影响

    图6  BMP?7转染对BMSCs合成骨钙蛋白的影响

    4  讨  论

    人骨形态发生蛋白7是TGF?β的超家族成员，其cDNA全长1293 bp，它包括1个开放阅读框架，由此编码产生由431个氨基酸构成的hBMP?7前体蛋白分为3部分，即信号肽段，前体肽段和成熟肽段［1］。BMP?7是BMP家族中诱导成骨能力最强的生长因子，BMP?7诱导骨髓基质干细胞向成骨方向定向分化的能力较强，而对已分化的成骨细胞则可使其碱性磷酸酶和骨钙蛋白表达增高，增强成骨活性［2］。当BMP?7植入体内后，激发间充质干细胞，随后这些细胞再分化为成骨细胞，钙化软骨重建，骨组织生成，最后髓腔再通。因此，BMP?7在促进骨折愈合、骨不连以及创伤性骨关节炎等疾病的中发挥重要的作用。可是外源性BMP?7因其半衰期短，须反复使用，治疗剂量相对较大，价格昂贵，且有可能导致毒性作用的产生而限制了其临床应用。分子生物学的促进了基因转移技术的出现，基因转移技术是将外源性目的基因转入细胞内并使之在细胞内表达的技术［3］。作者通过基因转移，将BMP?7的基因导入BMSCs，维持细胞的成骨能力并在局部持续表达BMP?7蛋白，从而发挥其诱导成骨效应，是骨再生及骨缺损修复的理想方法［4，5］。

    真核表达载体pcDNA3.1有以下几方面特点：（1）从结构上看，载体大小为5.4 kbp，该质粒载体具有很强的复制能力，其可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞浆遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；（2）含有高效增强子SV40，它是一类能促进基因转染活性的顺式调控元件，而且在目的基因前(多克隆位点前)装有功能很强的基因启动结构T7PCMV，这样使目的基因的表达得以保证；（3）具有安全、低毒、低免疫反应等优势，不象病毒性载体均存在着插入突变等致瘤、致毒的风险。靶细胞的选择是BMP?7基因治疗中非常重要的一环。骨髓基质干细胞具有来源广泛、取材简便、培养方法简单、体外扩增能力强、成骨能力明确等优点，是组织工程中理想的种子细胞［6］，同其他的靶细胞相比似乎更适合于作为BMP?7基因治疗的靶细胞。在本实验中，我们从兔骨髓内很容易的获取了2×105个BMSCs(原代)，这些细胞具有较高的增殖率，短期内产生足够的供移植用的细胞，避免了长期培养带来的花费高，易污染等弊端。

    在本实验中，BMSCs转染pcDNA3.1?hBMP?7后分泌BMP?7到细胞浆中并且释放到培养基中，这通过RT?PCR、免疫组织化学等方法得到了证实。BMSCs向成骨细胞分化的重要表现是细胞能够合成、分泌表达成骨特异性的蛋白和细胞外基质成分。碱性磷酸酶、胶原、骨钙蛋白的检测是常用指标。其中ALP作为BMP?7诱导成骨的早期标志，而胶原以及骨钙蛋白则作为成骨的晚期标志。羟脯氨酸是胶原蛋白中特有的成分，因此用氯胺T法测定羟脯氨酸可以反映BMSCs合成胶原的能力。实验组碱性磷酸酶、羟脯氨酸、骨钙蛋白合成均比对照组高，说明将BMP?7基因转入BMSCs中所合成表达的外源性BMP?7蛋白具有一定的生物学活性，能够促进BMSCs向成骨细胞转化。既然只有转染BMP?7的BMSCs向成骨细胞分化，而另外2组没有向成骨细胞分化，因此BMP?7是促进BMSCs向成骨细胞分化的决定性因素。

    将hBMP?7基因转入BMSCs中，表达的外源性BMP?7蛋白具有一定的生物学活性，能够促进BMSCs向成骨细胞转化，从而为利用基因转染的BMSCs构建组织工程化骨组织打下良好基础。

【】
  ［1］ Dorai H,Vukicevic S, Sampath TK. Bone morphogenetic protein?7 (osteogenic protein?1) inhibits smooth muscle cell proliferation and stimulates the expression of markers that are characteristic of SMC phenotype in vitro［J］.J Cell Physiol, 2000,184(1):37-45.

［2］ Yeh LC,Mikhailov V,Lee JO.Regulation of expression of plasminogen activator inhibitor?1 in cultured rat osteoblastic cells by osteogenic protein?1(BMP?7) ［J］.J Cell Biochem Suppl,2001,36:46-54.

［3］ Kofron M,Li X,Laurencin C. Protein and gene?based tissue engineering in bone repair［J］. Curr Opin Biotechnol, 2004,15:399-405.

［4］ Nussenbaum B,Rutherford RB,Teknos TN,et al.Ex vivo gene therapy for skeletal regeneration in cranial defects compromised by postoperative radiotherapy ［J］.Hum Gene Ther,2003,14(11):1107-1115.

［5］ 李建军，崔亚楠，韩冬，等.人骨形态发生蛋白?2腺病毒表达载体转染人骨髓间充质干细胞和对其增殖及分化的影响［J］.矫形外科杂志，2004，12（1）：60-62.

［6］ An VD,Thierry VD, Desire C,et al.Bone marrow stromal cells as targets for gene therapy［J］.Current Gene Therapy, 2002,2:195-209.