环氧合酶?2、p53在骨肉瘤中的表达及临床意义

【摘要】  探讨环氧合酶?2（cyclooxygenase?2，cox?2）蛋白、p53蛋白在骨肉瘤、骨软骨瘤组织中表达的差异性、相关性及临床意义。［方法］回顾本科1998~2004年间骨肉瘤患者档案，筛选术后石蜡切片40例作为试验组。男24例，女16例；年龄8~38（18.68±6.47）岁。筛选同期骨软骨瘤患者术后石蜡切片20例作为对照组。男13例，女7例；年龄9~27（17.95±4.77）岁。应用免疫组化（S?P）进行染色。光镜下观察染色切片，cox?2蛋白染色：以组织胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞；p53蛋白染色：以胞核内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。随机观察5个高倍视野，依照阳性细胞所占比例分为：“-”阳性细胞所占比例＜5%；“+”阳性细胞所占比例5％~25％；“++”阳性细胞所占比例26％~50％；“+++”阳性细胞所占比例＞50％。分别统计两者的阳性表达情况，所得数据应用SAS v6.12统计软件处理。采用chi?square test进行x2检验，α=0.05为水准，分别统计两者在骨肉瘤、骨软骨瘤组织细胞中阳性表达的差异性。采用Spearman等级相关分析法检验两者在骨肉瘤中阳性表达之间的相关性，α=0.05为水准。［结果］骨肉瘤组织中cox?2、p53蛋白的阳性率分别为67.5％和55.0％，显著高于对照组骨软骨瘤组织（P＜0.05）。cox?2、p53蛋白在骨肉瘤中的表达密切相关（rs=0.58，P＜0.05）。［结论］在骨肉瘤中，cox?2、p53参与了骨肉瘤的发生、，两者密切相关，相互协同。临床上联合检测两者对骨肉瘤的早期诊断和预后有重要意义。

【关键词】  骨肉瘤 骨软骨瘤 环氧合酶?2 p53 疫组化

     Abstract：［Objective］To observe the expressional variability and correlation of cox?2 and p53 protein between osteosarcoma and osteochondroma and explore their clinical significance.［Method］Sixty Specimens divided into 2 groups were taken from the department of pathology,Third Hospital of Hebei Medical University during 1998~2004.Among them,40（24 male and 16 female）aged 8~38（18.68±6.47）at time of therapy were from cases of osteosarcoma excision;20（13 male and 7 female）aged 9~27（17.95±4.77）from benign lesion of bone（osteochondroma）operation.Immunohistochemistry staining（Streptavidin?Peroxidasc,S?P method）was performed to detect the expressions of cox?2 protein and p53 protein in 40 cases of osteosarcoma.The criteria of positive expression was that brown granule was found in cytoplasm（cox?2）or in nucleus（p53）.The percentage of cox?2 or p53 positive expression in five high power fields was cunted randomly in each case.Positive（-）:positive oncocytes account ＜5%;Positive（+）:positive oncocytes account 5%~25%;Positive（++）:positive oncocytes account 26%~50%;Positive（+++）:positive oncocytes account＞50%.Software SAS v6.12 was used in data analysis.The difference of cox?2 and p53 expressions between osteosarcoma and osteochondroma was analyzed with Chi?square Test.Spearman method was used,with the standard α=0.05,to analyze the relationship between cox?2 and p53 expression among osteosarcoma.［Result］The positive rate of cox?2 and p53 expressions were 67.5% and 55.0% in osteosarcoma,there was noticeable distinction between osteosarcoma and osteochondroma,most of them was high.There was a positive correlation between them,rs=0.58,P＜0.05.［Conclusion］Cox?2 and p53 participate and closely correlate in the carcinogenesis and development of osteosarcoma.The detection of them might be a guide for the pristine diagnosis and prognosis of osteosarcoma in clinic.

    Key words:osteosarcoma;  osteochondroma;  eyelooxygenase?2;  p53;  immunohistochemistry

    骨肉瘤是一种高恶性肿瘤，早期即可发生肺部转移。故骨肉瘤的早期诊断至为重要。近数年来国内外多中心研究证实，cox?2，p53蛋白在多系统肿瘤中呈现过高表达，但在骨肉瘤中表达之间的关系少见报道，本实验应用免疫组化方法对此进行了初步研究。

    1  材料与方法

    1.1  临床资料

    收集河北医大三院骨病科1998~2004年间骨肉瘤标本40例作为试验组，男24例，女16例；年龄8~38（18.68±6.47）岁。另筛选同期骨软骨瘤标本20例作为对照组，男13例，女7例；年龄9~27（17.95±4.77）岁。

    1.2  免疫组织化学方法（S?P法）

    1.2.1  主要试剂

    cox?2羊多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）、p53兔多克隆抗体（美国Zyme公司）、SP?9003工作试剂盒，SP?9001工作试剂盒、DAB显色试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。

    1.2.2  试验步骤

    严格按照S?P试剂盒说明进行操作。

    1.3  结果判定

    由两位病理医生盲法判定，光镜下观察染色切片，以组织胞浆内（cox?2）或胞核内（p53）出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，随机观察5个高倍视野，依据阳性细胞所占比例分为：“-”阳性细胞所占比例＜5％；“+”阳性细胞所占比例5％~25％；“++”阳性细胞所占比例26％~50％；“+++”阳性细胞所占比例＞50%。

    1.4  统计中处理

    采用x2检验阳性表达的差异性。采用Spearman等级相关分析法检验阳性表达之间的相关性，α=0.05为水准。

    2  结  果

    2.1  40例骨肉瘤中27例cox?2蛋白染色显示为阳性（染色位于胞浆中），阳性率为67.5％。20例骨软骨瘤中仅3例显示低阳性结果，阳性率为15.0％（表1）。两者存在显著性差异，x2=14.7，P＜0.05有统计学意义。

    2.2  p53蛋白于22例染色显示为阳性结果（位于胞核中），且多为高表达，阳性率为55.0％。20例骨软骨瘤中均未显示阳性结果（表2）。两者存在显著性差异，x2=17.368，P＜0.05，有统计学意义。表1  cox?2在骨肉瘤、骨软骨瘤中的差异性表达情况表2  p53在骨肉瘤、骨软骨瘤中的差异性表达情况

    2.3  40例骨肉瘤标本中有18例cox?2、mt?p53蛋白染色均为阳性（图1、2），有9例染色均为阴性（表3）。通过Spearman等级相关分析法证实两者存在显著正相关，rs=0.58，P＜0.05，有统计学意义。 表3  cox?2、p53在骨肉瘤中的相关性表达情况注：rs=0.58,P＜0.05

　　3  讨  论

    近年来国内外多中心研究显示：cox?2、p53在多系统肿瘤均存在高表达，参与了肿瘤的发生、和转移，但在骨肉瘤中的相关研究少见报道。

    本研究主要探讨cox?2、p53在骨肉瘤的关系，为骨肉瘤的早期诊断、预后提供一种新的方法和标志。

    cox具有两种分型：环氧合酶Ⅰ型（cox?1）和环氧合酶Ⅱ型（cox?2）两种同工酶，cox?1是一种结构型酶，微量恒定表面在人体正常组织细胞中，参与机体正常生理过程，cox?2是一种诱导型酶，在生理细胞中基本不表达，在细胞受到各种刺激下迅速合成，参与多种生理及病理过程。Dickens等〔1〕对58例骨肉瘤和横纹肌肉瘤的组织进行了免疫组化研究，发现cox?2在82.8％的组织中表达阳性，且随着骨肉瘤和横纹肌肉瘤恶性程度和侵袭力的增高其表达率有增高的趋势。Maciag A等〔2〕对肺癌组织研究认为，突变型K?rasv 12导致cox?2水平明显上调，致使ROS增多出现DNA损伤，诱导细胞恶性变，同肺癌的发生、发展密切相关。Xu Z等〔3〕研究认为，cox?2在骨肉瘤中组织细胞中的过高表达，可通过增高ROS水平，降低细胞的生长能力而达到阻滞肿瘤细胞增殖，并且这种作用与肿瘤组织、细胞的种类有关。但本研究并未发现这种情况，在骨肉瘤中cox?2蛋白均呈过高表达，与肿瘤的组织类型无关。姜宇等〔4〕研究表明，骨肉瘤组织中存在cox?2的高表达，cox?2与骨肉瘤的新生血管生成密切相关，其高表达可能促进了肿瘤新生血管生成。本研究表明，骨肉瘤的发生、发展与cox?2的表达存在密切相关，与国内、外的相关肿瘤报道结果一致〔5〕。

     人类肿瘤中约有50％以上与p53基因的变化有关。p53基因分为野生型（wt?p53）和突变型（mt?p53）2种，其产物亦分为野生型p53蛋白和突变型p53蛋白2种。野生型p53蛋白极不稳定，半衰期仅为数分钟，对控制细胞周期、维持细胞遗传稳定性具有重要作用，并具有反式激活功能和广谱的肿瘤抑制作用。p53基因突变和等位基因缺失是导致mt?p53蛋白异常表达的主要原因。由于mt?p53蛋白的半衰期可延长至6~12 h，所以用抗mt?p53蛋白的抗体通过免疫组化的方法检测肿瘤组织，过高表达常提示p53基因存在错义突变。突变型p53基因则具有癌基因作用，促进细胞恶性转化。Singh等〔6〕研究发现p53基因参与了PI3K?PIP3?PKB诱导的凋亡途径。由此可推知，当p53基因由野生型突变为突变型时其诱导凋亡的功能丧失，大大增强了肿瘤细胞的增长。本研究中p53蛋白在骨肉瘤中呈现过高表达，在骨软骨瘤中均未表达，符合p53作为肿瘤抑制基因在恶性肿瘤中的表现。

    cox?2蛋白、mt?p53蛋白在骨肉瘤中的表达及其表达的相关性在国内外均未出现报道，Corcoran等〔7〕对结肠肿瘤研究认为，p53上调了cox?2的表达，反过来，cox?2阻滞了p53依赖性转录，从而导致p53削弱了自身的抗肿瘤，促进肿瘤细胞凋亡的作用，突变性p53蛋白同cox?2蛋白的表达水平呈正相关。Legan M等〔8〕研究认为，cox?2的过高表达在胆囊癌早期既已出现，且同野生型p53突变明显相关，两者之间存在相关性。本研究证实，cox?2，mt?p53在骨肉瘤组织中均呈现过高阳性表达，且证实cox?2蛋白、mt?p53蛋白在骨肉瘤中的阳性表达情况存在显著正相关，与上述相关文献结果近似。这说明它们的并存对于骨肉瘤的发生、发展起到了协同的作用。两者与骨肉瘤远处转移之间的关系有待进一步研究。

    cox?2可作为骨肉瘤靶向的新靶点，特异性cox?2抑制剂的出现为骨肉瘤的治疗提供了一条新的途径。冯尔宥等〔9〕研究表明cox?2特异性抑制剂噻莱昔布能够明显抑制骨肉瘤细胞的生长，从另一角度证明cox?2与骨肉瘤的发展有显著关系。本研究结果认为临床上联合检测cox?2蛋白、mt?p53蛋白，对骨肉瘤患者的早期诊断和预后具有重要意义。两者有望成为骨肉瘤的潜在标记物。

【文献】
  〔1〕 Dickens DS,Kozielski R,Khan J,et al.Cyclooxygenase?2 expression in pediatric sarcimas［J］.Pediatr Dev Pathol,2002,5（4）:356?364.

〔2〕 Maciag A,Sithanandam G,Anderson LM.Mutant KrasV12 increases cox?2,peroxides and DNA damage in lung cells［J］.Carcinogenesis,2004,25:2231?2237.

〔3〕 Xu Z,Choudhary S,Voznesensky O,et al.Overexpression of cox?2 in human osteosarcoma cells decreases proliferation and increases apoptosis［J］.Cancer Res,2006,66（13）:6657?6664.

〔4〕 姜宇，杨述华，李进，等.环氧合酶?2在骨肉瘤中的表达及与血管内皮生长因子相关性的研究［J］.矫形外科杂志,2004,11（12）:845?847.

〔5〕 Zhi YH,Liu RS,Song MM,et al.Cyclooxygenase?2 promotes angiogenesis by increasing vascular endothelial growth factor and predicts prognosis in gallbladder carcinoma［J］.World Gastroenterol,2005,11:3724?3728.

〔6〕 Singh B,Reddy PG,Goberdhan A,et al.P53 regulates cell survival by p52 inhibiting PIK3CA in squamous cell carcinomas［J］.Genes Dev,2002,16:984?993.

〔7〕 Corcoran CA,He Q,Huang Y,et al.Cyclooxygenase?2 interactswith p53 and interferes with p53?dependent transcription and apoptosis［J］.Oncogene,2005,24:1634?1640.

〔8〕 Legan M,Luzar B,Ferlan MV,et al.Expression of cyctooxygenase?2 is associated with p53 accumulation in premalignant and malignant gallbladder lesions［J］.World J Gastroenterol,2006,12（21）:3425?3429.

〔9〕 冯尔宥，夏仁云，张怡元，等.噻莱昔布对人骨肉瘤细胞MG?63增殖与凋亡的影响［J］.中国矫形外科杂志，2005,11（13）:853?855.