基质金属蛋白酶家族在骨关节炎软骨组织中表达的研究
作者：王玉彬，陈安民，郭风劲，夏玉军
【摘要】 目的］观察骨关节炎关节软骨中MMP?7、MMP?9、MMP?13和TIMP?1的表达，探讨其与软骨退变的关系及可能的作用机制。［方法］选取20例因骨关节炎行关节置换的软骨组织，常规HE染色观察其组织学形态，ABC免疫组化法观察关节软骨MMP?7、MMP?9、MMP?13和TIMP?1的表达，2例因意外受伤截肢患者的正常膝关节软骨标本作为对照。统计采用Mann?Whitney U非参数检验及相关分析。［结果］骨关节炎关节软骨出现裂隙、纤维化，软骨细胞增多、排列紊乱，并出现大量簇聚软骨细胞和肥大软骨细胞。MMP?7和MMP?13在正常软骨全层均呈低表达，但在退变软骨中的表达则明显增多，光密度值行U检验，两组差异有显著性(P＜0.01)。在正常与OA软骨的浅层，MMP?9和TIMP?1的表达无显著性差异(P＞0.05)；但在深层软骨中，OA软骨MMP?9和TIMP?1的表达较正常软骨明显增多，两组差异有显著性(P＜0.01)。［结论］MMP?7，13在OA软骨全层表达均多于正常软骨；MMP?9，13仅在OA软骨深层出现过多表达。MMPs与TIMPs的失衡是导致关节软骨发生组织学退变的原因之一。
【关键词】 MMP?7； MMP?9； MMP?13； TIMP?1； 骨关节炎
本研究通过观察MMP?7、MMP?9、MMP?13和TIMP?1在骨关节炎(osteoarthritis，OA)和正常软骨中的表达及改变，探讨基质金属蛋白酶及其抑制剂在OA发病中的作用，为OA病因研究提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 临床资料
OA患者共计20例，年龄在46～72岁，其中男性9例，女性11例。OA病人均符合Altman等〔1〕的OA诊断标准。分别行人工膝关节置换术及全膑切除术，术中留取关节软骨。对照组为因意外受伤截肢患者2例(男女各1例)，年龄分别为23岁和28岁，无OA病史，术中取正常关节软骨。
1.2 研究方法
手术后1 h内，关节软骨用生理盐水冲洗，切成1.0 cm×0.8 cm×0.5 cm小块，用10％中性多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm切片。一部分切片行HE染色，光镜下观察关节软骨软骨细胞的组织形态。一部分切片行免疫组化ABC法染色，光镜下选取不同视野观察并照相，运用显微图像分析系统测定软骨组织中MMP?7、MMP?9、MMP?13和TIMP?1的平均光密度值。
1.3 统计学分析
应用SPSS 10.0软件进行统计学处理，计量资料用x-±s表示。用Mann Whitney U非参数检验。
2 结果
2.1 HE染色结果
OA早期关节软骨有小裂隙，少量簇聚的软骨细胞和单个肥大的软骨细胞，潮线断裂，或出现双重潮线。中期有裂隙深达中、深层，细胞致密，核膜不清，排列紊乱，有大量簇聚软骨细胞和肥大软骨细胞。后期软骨有深至软骨下骨的裂隙，表层不完整甚至缺失，软骨下骨外露，有骨赘或象牙骨形成；细胞少，排列无层次感，有大量簇聚软骨细胞，潮线消失；基质染色明显不均，细胞的密度明显增加，胞核、胞质结构无法辨认，可见核固缩，碎裂或溶解，可见坏死软骨细胞。
2.2 免疫组化染色检测结果
MMP?7、MMP?9、MMP?13和TIMP?1免疫组化染色检测结果见表1～4。
表1 MMP-7免疫组化染色的ABSORBANCE值结果（略）
*与正常软骨相比差异有显著性（P＜0.01）
表2 MMP-9免疫组化染色的ABSORBANCE值结果（略）
*与正常软骨相比差异有显著性（P＜0.01）
表3 MMP-13免疫组化染色的ABSORBANCE值结果（略）
*与正常软骨相比差异有显著性（P＜0.01）
表4 TIMP-7免疫组化染色的ABSORBANCE值结果（略）
*与正常软骨相比差异有显著性（P＜0.01）
3 讨论
导致OA患者膝关节软骨细胞的改变的原因有很多，归结起来大致有以下几种因素：即肥胖、运动不当、气候不佳和不良的生活习惯等外界因素，内分泌紊乱，损伤，免疫学异常，细胞凋亡，细胞因子及酶的作用等〔2、3〕。当关节软骨受损后，胶原纤维所形成的“网状拱形结构”受到破坏，受压的软骨细胞则出现退行性变，大量簇聚软骨细胞、肥大软骨细胞产生；到后期随着软骨细胞受压的继续加重，软骨内环境的持续性恶化，甚至出现软骨细胞的坏死。
在正常软骨中，软骨细胞会把合成的大量II型胶原、蛋白多糖(PG)等物质分泌到细胞外基质(ECM)中，构成细胞外纤维网架，给细胞提供支持与保护〔4〕。这些物质最终在基质金属蛋白酶(MMPs)的作用下降解。当软骨受损后，软骨细胞所产生的MMPs的量发生了改变，导致了ECM的产生与降解之间的平衡被打破，ECM被大量降解，软骨细胞周围的环境和胶原遭到了破坏，从而导致OA的发生。
已知MMPs有10余种，主要可分为胶原酶(MMP?1，8，13)，基质溶解素(MMP?3，7，10，11)〔5〕，明胶酶(MMP?2，9)等亚家族，不同的MMPs对ECM不同组分降解的特异性有所不同。MMPs的特异性抑制因子为TIMPs(Tissue lnhibitor of Matrix Metalloproteinases)，已报道的有4种，其中TIMP 1主要抑制MMP?1、MMP?3、MMP?9，它能与MMP?9的酶原通过每个分子的羧基端形成一种分泌络合物，从而抑制其活性。
研究发现，正常情况下MMP?13只在表层软骨细胞中有表达；而在骨关节炎关节软骨中，MMP?13不仅仅是在表层，甚至在中层以及深层的簇积软骨细胞中均有较正常关节软骨细胞的过量表达。龙厚清〔6〕的研究也说明，胶原酶在OA软骨中出现的异常性表达增多，促进了软骨组织中胶原的降解，尤其是Ⅱ型胶原。同时发现MMP?7的表达也明显增多，其表达部位与MMP?13相同。虽然MMP?9在OA软骨中的表达亦出现了一定程度的增高，但其增多的幅度低于MMP?7与MMP?13，仅在软骨的深层出现过度表达。对照出MMP?7，MMP?13与MMP?9表达增多的不同步性，相对于MMP?9而言，MP?7和MMP?13更能够反映OA的病理性改变，可作为OA软骨检测的标志性酶。
实验发现TIMP?1虽然在OA软骨的深层出现了过量表达，但与MMPs的升高并不同步，相对MMPs仍呈低量表达。在正常关节软骨中MMPs和TIMPs的分泌水平保持平衡，TIMP?1基本分泌量对维持关节软骨的完整性具有重要作用。但在OA软骨中，由于TIMP?1的相对表达量少于MMPs，这就使得MMP?7，9，13的降解作用过分发挥，所对应的ECM组分过量降解，促进软骨退变。
OA患者关节软骨的损害是基质金属蛋白酶与细胞因子等因素共同作用的结果。在OA早期，TIMPs的分泌量与MMPs的量大致相等，软骨试图进行自我修复，这是一个较为漫长的过程。但是由于不及时，软骨的负重未得到及时解除，软骨细胞的损伤继续加剧，更多的软骨细胞出现退行性改变，导致大量的分解性细胞因子的表达。到OA晚期，由于软骨细胞大量损伤、死亡，软骨细胞的量大大减少，分解性细胞因子和MMPs的量会出现相应的减少，但损伤依然继续。
【】
〔1〕 孙天威，安荣泽，史可中,等.MMP?7在骨关节炎中的表达［J］.贵州医药,2002,26(2).
〔2〕 谢丹.关节软骨细胞凋亡与骨性关节炎的相关机制［J］.康复，2001,5(5)：111.
〔3〕 司全明,侯筱魁,唐敏,等.关节内骨折后受损软骨细胞凋亡的实验研究［J］.矫形外科杂志,2002,9(7):675?677.
〔4〕 Pelletier JP,Lascau?Coman VJ,Jovanovic D，et al.Selective inhibition of inducible nitric oxide synthase in experimental oateoarthritis is associated with reduction intissue levels of catabolic factors［J］.Rheumatol，1909，26：2002?2014.
〔5〕 郭秦炜，田得祥，敖英芳.骨性关节炎关节软骨中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型及Ⅹ型胶原的分布［J］.中国运动医学杂志，2002,21(3)：228?231.
〔6〕 龙厚清.基质金属蛋白酶与腰椎间盘退变的关系［J］.中国矫形外科杂志,2000,7(4)：393?395.
