大鼠腰椎间盘针刺退变模型的建立
作者：崔力扬，刘尚礼，丁悦，黄卫国，洪国斌，黄东生，马若凡
【摘要】 ［目的］建立大鼠腰椎间盘针刺退变模型并进行MRI和组织学观察。［方法］Sprague-Dawley大鼠32只，20只进行腰椎间盘纤维环厚度测量，确定针刺深度；12只经腹膜手术，L3、4、L4、5、L5、6椎间盘使用21G针分别行纤维环部分针刺或全层针刺，L6S1椎间盘作为对照，术前及术后4、8周行MRI检查，然后处死，椎间盘行HE染色。［结果］测量大鼠腰椎间盘纤维环厚度后，确定适用于L3、4、L4、5、L5、6、L6S1椎间盘纤维环部分针刺深度为1.5 mm，纤维环全层针刺深度为2.3 mm。MRI检查在纤维环全层针刺4周，部分针刺8周后的椎间盘信号强度显著降低。组织学检查发现纤维环全层针刺和部分针刺椎间盘4周时都发生退变，而纤维环全层针刺退变较严重。［结果］纤维环部分针刺或全层针刺方法可以成功建立大鼠腰椎间盘退变模型，方法可靠、有效、重复性好。
【关键词】 椎间盘； 退变； 动物模型； 纤维环针刺； 大鼠
腰椎间盘退变性疾病在人群中的发生极普遍，严重影响了患者的生活质量，造成大量社会资源的消耗；而椎间盘退变牵涉到一系列的复杂的形态学、生物力学、生物化学和生物学行为的改变，正在的新的手术技术和生物学方法在用于人类之前，需要经过合适的动物体内退变模型去正确分析和验证。纤维环损伤模型自1948年Key等〔1〕成功应用于狗后，广泛用于椎间盘退变的研究。大鼠是制作椎间盘退变模型的常用动物〔2、3〕，但应用于纤维环损伤模型的报道尚少〔4〕，本实验的目的是通过前路经腹膜手术，建立大鼠部分及全层纤维环针刺模型，并由MRI和组织学方法加以检验。
1 材料和方法
1.1 实验动物
12个月龄Sprague-Dawley（SD）大鼠32只，清洁级，雄性，体重（450±20）g，由中山大学动物实验中心提供，单笼清洁饲养。
1.2 SD大鼠腰椎间盘纤维环厚度测量
麻醉后，处死20只SD大鼠，完整取出腰椎间盘，对L3、4、L4、5、L5、6、L6S1椎间盘纤维环进行测量（因L1、2、L2、3椎间盘体积小且不易手术暴露，故未测量）。测量方法：水平（腹背）切开椎间盘，每个椎间盘切开的两部分都给予测量，通过显微镜在标尺下对椎间盘摄像，图像在机中加以分析；以椎间盘矢状轴为基线，从椎间盘前部（腹侧）分别以0°、30°、60°向髓核中心画线，确定纤维环与髓核的交界点，纤维环穿刺的厚度（mm）＝纤维环厚度+附着于纤维环的韧带厚度（图1）。
图1大鼠纤维环厚度测量方法 AF代表纤维环，NP代表髓核，a、c、e为椎间盘前部（腹侧）边缘，bdf为纤维环与髓核交界点；以椎间盘矢状轴为基线，从椎间盘前部（腹侧）分别以0°、30°、60°向髓核中心画线，ab、cd、df分别代表纤维环厚度（包括附着于椎间盘的韧带）（略）
1.3 动物模型的建立
1.3.1 实验动物分组
SD大鼠12只，对每只大鼠L3、4、L4、5、L5、6椎间盘分别随机实施纤维环部分或全层针刺1针（即有2个椎间盘要实施同一种针刺方法），L6S1椎间盘作为对照。穿刺针21G，纤维环部分针刺深度为1.5 mm，纤维环全层针刺深度为2.3 mm。
1.3.2 手术操作步骤
术前X线片定位，大鼠称重，10％水合氯醛腹腔注射（0.03 ml/kg）。麻醉成功后腹部剪毛，清洁，仰卧位，固定四肢，碘伏消毒铺巾。取右侧旁正中切口，长约1.5～2.0 cm，远端略过髂嵴2～3 mm。将肠管及大网膜用湿纱布向头侧、对侧推移，暴露腹后壁，剪开腹后膜，保护好下腔静脉，将腰大肌从脊柱附着点上节段性剥离（髂嵴平对L6椎体或L5、6椎间盘）暴露L3、4、L4、5、L5、6、L6S1椎间盘，针刺角度与椎间盘矢状面呈0°～60°，平行于软骨终板进针。针刺成功后，缝合腹膜层，肌层、关闭皮肤。术后观察步态，进食，有无尿潴留，伤口感染。
1.4 MRI检查
麻醉下，术前所有的大鼠行磁共振成像（magnetic resonance image，MRI）扫描，然后在4、8周随机抽取6只进行MRI扫描，采用1.5T西门子公司MRI扫描检查腰椎间盘信号。矢状面T2扫描参数：TR/TE 3 500/100 ms，Fov12，层厚3 mm，间隔0 mm。判断椎间盘退变的标准为椎间盘在T2WI上的信号强度和面积变化，依据改良的Thompson标准分为4级〔5〕：1级，正常；2级，信号微减弱但高信号区面积明显缩小；3级，信号中等减弱；4级，信号明显减弱。
1.5 组织学检查
MRI检查结束后处死，完整取出L3、4、L4、5、L5、6、L6S1椎间盘，10％中性福尔马林室温下固定24 h，10％EDTA脱钙1周，水平面切片5张，层厚4 μm，行HE染色。光镜下观察椎间盘形态变化。病理结果进行评分〔5〕（表1）。
表1 组织学分级评分（略）
备注组织学分级评分根据椎间盘退变4个方面，评分范围从正常椎间盘组织4分（符合每类中的第1条）到严重退变12分（符合每类中的第3条）。
1.6 统计分析
MRI和组织学分级为非参数数据，采用SPSS 10.0进行统计学处理，Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney U检验，P＜0.05。
2 结果
2.1 椎间盘纤维环厚度测量结果（表2）
表2 大鼠腰椎间盘纤维环厚度（略）
确定适用于L3、4、L4、5、L5、6、L6S1椎间盘的纤维环部分针刺深度为1.5 mm，纤维环全层针刺深度为2.3 mm。
2.2 手术后按术前条件饲养
大鼠1 d后恢复正常进食，未见伤口感染，尿潴留；其中1只大鼠术后3 d死亡，原因为连续缝合线被咬断，腹腔内容物流出；1只出现右下肢跛行，1周后恢复。
2.3 MRI结果
显示正常椎间盘影像；4周时纤维环全层针刺的椎间盘显示出信号降低，强信号面积缩小，而纤维环部分针刺的椎间盘信号略降低，强信号面积无明显变化；至8周时纤维环全层针刺的椎间盘呈现出“Dark disc”（图2）,纤维环部分针刺的椎间盘信号明显降低。统计学结果显示纤维环部分和全层针刺组术后4周和8周时MRI结果评分比对照组显著升高；纤维环全层针刺组4周及8周时分别比部分针刺组显著升高（Bonferroni校正后，P＜0.01，Mann-Whitney U检验）（图2）。
2.4 病检查
正常椎间盘纤维环层次分明，与髓核界线明显，髓核呈凝胶样外观；纤维环部分针刺的椎间盘4周时可以发现半数纤维破裂，纤维环与髓核界线轻微模糊，但髓核仍然保持凝胶样外观；8周时可以看到纤维环与髓核界线明显中断，髓核丧失凝胶样外观；纤维环全层针刺的椎间盘组织学改变明显，4周时可以看到髓核中有大量不定形物质，纤维环髓核界线模糊，8周时见椎间盘呈破絮状，有大量不定形物质和坏死的椎间盘细胞，不能明确分清纤维环和髓核的界线。针刺裂口周围可见大量死亡的椎间盘细胞，裂口开始时是局部的，完全针刺4周，不完全针刺后8周发现裂口已经逐渐到对侧，并且髓核出现了纤维化。统计学结果显示纤维环部分和全层针刺组术后4周和8周时组织学结果评分比对照组显著升高；纤维环全层针刺组4周及8周时分别比部分针刺组显著升高（Bonferroni校正后，P＜0.01，Mann-Whitney U检验）（图3）。
图2a为正常椎间盘MRI影像；2b,c分别为纤维环全层针刺后4、8周的MRI影像；2d为统计处理结果，***P＜0.01 （略）
图3a为正常椎间盘HE染色（×200）；3b，c分别为纤维环全层针刺后4、8周的HE染色（×200）；3d为为统计处理结果，***P＜0.01（略）
3 讨论
本实验对大鼠前路经腹针刺纤维环的深度进行了较为精确的测量，所确定的纤维环部分针刺深度为1.5 mm，纤维环全层针刺深度为2.3 mm，为椎间盘内进行干预提供了准确的途径。
传统的采用11号刀片损伤纤维环动物模型，可以较快引起椎间盘退变，但Masuda等〔5〕认为引起退变过于迅速，不符合人类腰椎间盘退变的，11号刀片2周就可以引起兔椎间隙狭窄，但不再进展；而针刺引起的退变相对缓慢，椎间隙狭窄程度随退变不断进展。
研究表明针刺椎间盘退变的程度和速度与针的尺寸、针刺次数密切相关。An等〔6〕认为27G针损伤兔纤维环后不引起椎间盘退变，适合椎间盘中注射生长因子、质粒、药物、细胞等物质；而Kim等〔7〕采用21G针刺3针比18G刺1针能够更快的引起兔椎间盘退变；Sobajima等〔8〕采用16G针刺兔椎间盘，MRI在3周时发现椎间盘开始退变。本实验4周时通过MRI和组织学检查发现纤维环部分和全层针刺均能导致大鼠椎间盘退变，而纤维环全层针刺较部分针刺退变程度严重。
在手术入路的选择上，预实验中，发现大鼠横突较长、向腹侧突出，环抱腰段脊柱，腰背肌发达，后路及侧入路要去除横突，过多剥离肌肉，创伤大，出血多，视野不清晰。前入路在解剖定位准确后，腰大肌的剥离是节段性、小范围的，不损伤椎体前血管的情况下，出血较少。相对后路及侧入路可以有效避免对后方骨性结构的破坏及大量剥离肌肉后引起的脊柱应力的变化。借助手术显微镜，可以做到微创。
纤维环损伤在人类腰椎间盘是很常见的〔9、10〕，利用针刺纤维环建立腰椎间盘退变模型是一种有效、操作简单、成功率高、重复性好的方法，椎间盘退变缓慢进展与人腰椎间盘退变的发展规律相似。
【】
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