应用活性玻璃/rhBMP2构建生物活性材料支架的相容性研究

           作者：丁金勇，靳安民，闵少雄，张梅霞，汤善华，王永峰 

【关键词】  成骨细胞

    观察BG／rhBMP2构建的三维立体材料支架的细胞相容性、组织相容性，为进一步改善材料性能提供依据。［方法］体外培养的兔成骨细胞分别与BG和BG／rhBMP2材料支架联合培养，倒置显微镜、扫描电镜观察细胞黏附情况，MTT法分析细胞增殖情况；将复合培养的两种支架材料植入兔肌袋中，同期观察复合材料及空白对照组，分别于术后2、4、8、12周来评价其组织相容性。［结果］MTT法结果显示：随着培养时间的延长，各组细胞数量都明显增加，各时间点复合材料支架组细胞数高于空白对照组，差异有显著性意义，复合材料支架BG／rhBMP2在细胞贴壁时间和细胞活性方面均较单纯支架优良；两种支架材料在体内均无明显炎症反应。［结论］BG／rhBMP2是一种具有良好生物相容性的支架材料，有望在骨组织工程中得到广泛应用。

    关键词：细胞培养；  成骨细胞；  生物活性玻璃；  重组人骨形态发生蛋白2；  生物相容性

    Abstract：［Objective］To investigate the compatibility of tissue and cell in the threedimensional porous bioactive glass/recombine human Bone Morphogenetic Protein2 (BG /rhBMP2)materialscaffolds and provide a reference for improving the constitution of composite material.［Method］The material of BG and BG/rhBMP2 were cultured in vitro with rabbit osteoblasts respectively. The morphology and adhesion  were  examined  by  inverted microscope  and  scanning  electron microscope, and the cell proliferation was detected by MTT assay. The composite materialscaffold were embeded in rabbit's muscle and incisions were observed. The specimens were harvested in 2, 4, 8 and 12 weeks respectively and examined by histology to evaluate the tissue response.［Result］The results showed the cells on BG and  BG /rhBMP2 were good adhension and activity, the two  materialscaffolds had no apparent inflammatory reaction in vivo. MTT assay showed the number of the cells in each group were significantly increased along with the culture time prolonged. The number of cells in the BG and  rhBMP2 group was higher than that of the control group at different intervals, with a significant difference. The number of cells in the BG/rhBMP2 was not evidently higher than that of the BG with a significant difference.［Conclusion］The porous composite materialscaffold of BG/rhBMP2 has good biocompatibility with the hope to wide use in bone tissue engineering.

    Key words: Cell culture;  Osteoblasts;  Bioactive glass;  Recombine human Bone Morphogenetic Protein2;  Biocompatibility

  具有三维空间结构的材料支架、种子细胞和生长因子并称为组织工程的三大核心问题［1］。生物活性支架材料的选择是其能否应用于临床的关键，生物活性玻璃是具有硅酸盐性质的异质移植材料。本文所用支架材料是将生物活性玻璃粉与无机造孔剂结合制成了生物活性玻璃多孔材料。本实验立足于探讨生物材料、生长因子复合体与成骨细胞及组织的生物相容性，判断其在骨组织工程研究中的应用前景。

    1  料和方法

    11  材料的制作

    111  成骨细胞培养  10周龄新西兰大白兔(体重、雌雄不限)，(购自南方医科大学实验动物中心)，无菌条件下抽取双侧股骨髁部骨髓10 ml，按方法分离培养。成骨诱导剂与RPM1640组成完全培养基，将第2代细胞接种至培养板和培养瓶中，每孔加入完全培养基，48 h后全量换液，置于孵箱内培养。

    112  生物活性玻璃(bioactive glass BG)支架材料制作  BG的分子质量10 g，为固体块状。选择粒径在150～200μm BG颗粒，应用溶胶-凝胶技术制得孔径约220 μm，孔隙率约75％的BG支架材料，切割成直径8 mm、厚约2 mm的薄片状，环氧乙烷熏蒸消毒备用。

    113  复合载体的制备  已消毒的rhBMP溶解于RPM 1640液中，将切割BG浸入其中，置入700 MPa的真空仓中，使BG孔隙中空气被置换，取出后烤干。

    12  成骨细胞鉴定

    121  细胞碱性磷酸酶(ALP)化学染色  将诱导分化的细胞培养10 d后采用偶氮偶联法染色，阳性细胞胞浆内有大紫黑色颗粒或弥漫深红色。

    122  I型胶原抗体免疫组化染色  诱导分化的细胞培养8 d后固定、洗涤、过夜；用DAB显色试剂盒显色，复染、脱水、封固。

    13  成骨细胞与支架材料联合培养

    用RPM 1640培养基浸泡支架材料，将消化的成骨细胞制成的细胞悬液，将支架材料置于培养板中，设立空白对照，加入与支架相同大小的盖玻片1片，接种细胞悬液，孵箱培养，每2 d半量换液1次。

    14  细胞培养观察

    倒置显微镜、扫描电镜观察成骨细胞及其在材料上的生长、贴附情况；于接种后的2、4、6、8 d吸出培养基后每孔加入RPM1640培养基及四甲基偶氮唑盐(MTT)，在酶联免疫检测仪上测定A值；碱性磷酸酶活性测定按ALP试剂盒提供的方法进行。

    15  动物实验

    30只12周龄新西兰大白兔(雌雄不限)，体重(1600±200)g，随机排列分为3组，每组10只。腹腔麻醉，背部做切口，钝性分离肌肉组织，将材料随机植入脊柱两侧肌肉组织，分别于术后2、4、6、8、12周后处死动物，切取植入区组织块，进行大体观察、光镜下观察。

    16  统计学处理

    用SPSS100软件包多因素变化分析(ANOVA)分别比较各实验组与对照组指标的变化，LSD法行两两比较进行统计学分析。

    2  结  果

    21  成骨细胞培养

    MSCs：原代细胞经成骨诱导剂诱导4 d后，向成骨细胞分化。7 d后长满瓶底，继续培养后拥挤生长，成为成熟的成骨细胞：细胞呈类圆形、多角形，体积变大，含较多胞浆颗粒，排列如铺路石样(图1)。

    22  细胞支架联合培养观察  细胞接种24 h后，成骨细胞大部分贴壁，呈梭形，均匀分布于培养孔内，材料周围、远侧的细胞数量、形态无差异。培养第2 d，细胞开始增殖，以材料周围和培养孔周缘最明显；培养第4 d，细胞数量明显增多，形态仍以梭形为主，并出现较多量的三角形、多角形细胞，细胞贴附于材料的边缘，材料孔隙内可见成骨细胞贴伏成星形，突起向孔隙壁延伸。培养第8 d，材料周围、孔隙内、培养孔周缘的细胞连接成片，细胞分泌旺盛，呈多角形，胞体间紧密连接；培养第12 d，细胞密度进一步增高，细胞沿材料表面及孔隙内生长，细胞与材料界限模糊(图2)。BG／rhBMP2组与BG组有类似改变，未见明显区别。

    23  扫描电镜观察

    在培养早期，材料表面和孔隙内均有散在的细胞附着，细胞多呈球状，随着培养时间的延长，材料表面和孔隙的细胞数量逐渐增多，并向孔隙深部长入，细胞突起增多，细胞跨越于孔隙中，细胞形态以球形为主(图3)；BGrhBMP2与BG两组材料细胞密度明显高于空白对照组，BG／rhBMP2与BG组间未见明显差异。

    24  MTT法测定成骨细胞增殖(表1)。培养结果显示：随着培养时间的延长各组细胞数量都明显增加，各时间点BG、BG／rBMP2组细胞数高于对照组，差异显著(P<０05)；BG／rhBMP2组细胞数略高于BG组，差异不明显(P>005)。

    25  碱性磷酸酶活性测定

    ALP染色显示：细胞胞核周围呈黄褐色分泌。定量分析结果显示(表2)：在各时间点均可以检测到ALP活性，3组之间有显著性差异。

    26  大体观察  实验动物术后顺利苏醒，植入区伤口无渗出，埋植区术1 d后内稍隆起，可见皮肤充血。1周后动物活动正常，伤口全部愈合。 表1  3组材料中细胞增殖结果表2  3组材料中ALP含量测定值

    27  组织学观察

    2周组，两组材料周围出现厚而疏松的纤维包膜，界限不清，有较多巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和异物巨细胞浸润，成纤维细胞增生明显； BG／rhBMP2组周围出现较薄的完整且相对疏松的纤维包膜，其中主要为巨噬细胞、淋巴细胞和异物巨细胞浸润(图5)，中性粒细胞较BG组少。4周组，两种材料周围炎细胞浸润和毛细血管充血均明显减轻。BG组周围的纤维包膜变薄且疏松，进入材料内的炎症细胞和成纤维细胞增多；BG／rhBMP2周围纤维包膜进一步变薄，其中成纤维细胞明显增多，淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞、中性粒细胞和异物巨细胞明显减少，进入材料内的炎症细胞和成纤维细胞较少。8周组，两种材料周围炎细胞浸润和血管充血进一步减轻，纤维包膜变薄，BG的材料边缘部分可见异物巨细胞，淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞的胞质颗粒相对丰富，进入材料内成纤维细胞明显增多；而 BG／rh BMP2中性粒细胞和异物巨细胞很少见。12周组，两种材料周围几乎不见血管充血和炎症反应，纤维包膜变薄，仅由3、4层细胞组成，BG组仍可见较多巨噬细胞和少量异物巨细胞，有较多的淋巴细胞和巨噬细胞以及纤维成分进入材料(图6)； BG／rhBMP2淋巴细胞和巨噬细胞少见，纤维膜变薄但仍较完整，与肌肉组织界限模糊。

    3  讨  论

    31  生物相容性评价的应用

    体外细胞培养法作为初步评价材料生物相容性的方法，它简单、敏感。此方法主要观察细胞在材料中生长情况，细胞增殖及功能的表达等。本实验支架材料与细胞联合培养显示细胞在材料上能良好的黏附。MTT法显示随着培养时间的延长各组细胞数量都明显增加，同组内各时间点差异非常显著(P<001)，说明材料对成骨细胞无毒性，成骨细胞与材料的联合培养中黏附、增殖良好。

    32  复合支架材料组织相容性

    表明BG具有较好的生物相容性，实验所用材料因加入无机造孔剂和生长因子，改善了其表面活性，生物相容性更好。多孔BG／rhBMP2植入体内后动物无死亡及感染，植入早期组织学观察存在一定的中性粒细胞和淋巴细胞，这是手术损伤、刺激引起的一种急性反应，在植入8周时这种反应趋于平静，而多核巨细胞的出现则是一种异物反应，随着时间的延长逐渐减少，是良好组织相容性的表现。该材料植入体内后在早期出现厚而疏松的纤维包膜，随着时间的推移，纤维包膜变薄且相对疏松和不平整，12周时则包膜有向材料表面突入的现象，材料所占腔隙减小，说明材料有降解。这说明该支架材料具有一定的生物活性，同时降解的微小颗粒可能是引起后期多核巨细胞出现的原因。

    33  BMP2作为转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员，是多效性的调控因子，能刺激间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞方向分化。BMP的促细胞分化作用主要通过增加细胞内ALP的活性、骨钙素和胶原蛋白的含量而发挥作用［2］。本实验在BMP2作用下细胞增殖不明显，但显示ALP活性明显增强。这表明成骨细胞受TGF-β刺激细胞增殖影响轻微，分化能力增强［3］。BMP在修复骨缺损中单纯应用效果并不理想，必须有合适的载体材料与其复合，起到令BMP缓释及提供骨细胞生长支架的作用［4］。多年前，生物玻璃被发现能与骨形成骨键结合，生物活性玻璃的活性是由基因调制的。具有骨促进作用的生物活性玻璃通过直接对那些调节诱发细胞周期开始和进程的基因的直接控制，从而加强了骨形成和促进作用［5］。实验所用BG作为BMP的缓释载体，延长了其因子释放时间，同时BG通过直接对BMP生长因子的控制，使成骨细胞能在生长因子的调控下增殖，加强了骨形成和促进作用，使BG和rhBMP2的作用互相促进。

    34  实验前期结果显示，BG／rhBMP2支架的网孔和表面结构，在与细胞联合培养时，不但有较好的促细胞粘附作用，而且有利于粘附后的细胞伸展及活性表达。复合材料释放的rhBMP2能维持有效剂量并持续表达，达到了缓释目的。细胞数量随培养时间明显增加，说明材料有利细胞的增殖。BG／rhBMP2组不同时期的炎症反应与异物反应都明显少于单纯BG组，后期BG／rhBMP2材料周围形成的纤维膜尽管进一步变薄，并向材料内长入，未出现完全降解现象。此特点有利于保存支架材料早期的空间结构，使降解速度于新骨的生成速度匹配，为成骨细胞进一步的增殖提供了保证；同时支架材料在体内形成的包膜形成了一定的物理屏障，将结缔组织阻挡于骨缺损之外，为进一步利用细胞-因子-材料复合移植修复骨缺损的可行性提供依据。

    文献：

    ［1］  Athanasiou KA, Zhu C,Lanctot DR. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone［J］．Tissue Eng,2000,6(4):361-381.

    ［2］  谭祖键，李起鸿.BMP及其诱导成骨的分子生物学基础［J］.中华骨科杂志，1996，16：587-589．

    ［3］  Chen JL, Hunt M,Mcelvain M, et al. Osteoblast precursor cells are found in CD34 cells from human bone marrow［J］．Stem Cells, 1997,15:368-377．

    ［4］  覃翌，裴国献.骨形态发生蛋白缓释载体的研究进展［J］.临床康复，2003，7(23)：3242-3243．

    ［5］  Hench LL,Xynos I,Edgar A,et al.激活基因的玻璃［J］.无机材料学报，2002，17(5)：897-909．